CXCL13激活小膠質細胞參與瑞芬太尼誘發疼痛過敏

張熙 王光杰 張娟 薛銳

1湖北醫藥學院附屬人民醫院麻醉科（湖北十堰 442000）；2湖北醫藥學院附屬太和醫院神經內科（湖北十堰 442000）

阿片誘發的痛覺過敏（opioids?induced hyperal?gesia，OIH）是指輸注阿片類藥物引起的痛域降低。OIH不僅促進痛覺感知，引起痛覺異常，甚至出現慢性疼痛癥狀［1］。阿片誘發痛覺過敏的發生速度與阿片類藥物特性密切相關，藥物作用時間越短，耐受發生越迅速，瑞芬太尼是一種超短效的μ?受體激動劑，因其起效迅速、作用時間短。因此瑞芬太尼較其他阿片類藥物發生痛覺過敏更快，而這種耐受和痛覺過敏又呈劑量依賴性［2］。但瑞芬太尼誘發的痛覺過敏機制仍不清楚，因此了解其具體發生機制仍是臨床鎮痛用藥關注的難題。趨化因子CXC配體13（CXCL13）屬于CXC趨化因子家族，已經被證明在神經損傷后產生的快速而持久的觸覺和熱感覺異常中，通過上調脊髓束中的炎癥因子產生表達［3］。CXCL13在神經系統中存在表達，并通過激活神經膠質細胞參與神經病理性痛、炎性痛等慢性疼痛的形成與維持［4］。但CXCL13是否與瑞芬太尼誘發的痛覺過敏有關尚無定論，因此，本研究旨在觀察CXCL13在瑞芬太尼誘發的痛覺過敏中的表達情況，并進一步探討其如何參與其痛覺過敏的過程。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理 選擇成年健康SD大鼠（SPF級）20只，體質量200～250 g，雌雄不限，由湖北醫藥學院實驗動物中心提供。隨機分為4組，每組8只：切口痛組（C組），瑞芬太尼組（R組），NC?siRNA慢病毒組（NC組）和CXCL13?siRNA慢病毒組（CX組）。腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉后，參照Brenman法［5］建立疼痛模型。尾靜脈泵注I組：生理鹽水10 μg/（kg·min），持續1 h；R組：鹽酸瑞芬太尼注射液（宜昌仁福制藥公司）10 μg/（kg·min），持續1 h；NC組：鞘內注射注射NC?siRNA慢病毒（上海吉凱基因化學技術有限公司）10 μL（108TU/mL）30 min后，尾靜脈泵注瑞芬太尼10 μg/（kg·min），持續1 h；CX組：鞘內注射CXCL13?siRNA慢病毒（上海吉凱基因化學技術有限公司）10 μL（108TU/mL）30 min后，尾靜脈泵注瑞芬太尼10 μg/（kg·min），持續1 h。

1.2 機械痛閾檢測 分別于造模前1 h，術后2、6、12、24 h時采用von FreyTM動態足底觸覺測量儀（UGO公司，意大利）測定大鼠機械縮足閾值（MWT）。大鼠置于金屬籠（10 cm×10 cm×15 cm），適應環境20 min，處于靜息狀態時，開始測定，von Frey絲由下向上垂直刺激右側足底中部皮膚，設定20 s內刺激逐漸由0升高為50 g，當出現快速縮足反應時，刺激自動停止，記錄壓力值，共測3次，間隔5 min，取其平均值作為大鼠機械縮足閾值（MWT）。

1.3 免疫熒光雙標檢測 痛閾測定結束后，麻醉下取L4～6脊髓組織常規固定，30%蔗糖脫水至沉底，冰凍連續切片（厚15 μm），加入封閉液，室溫孵育30 min，PBS漂洗后，同時加入CXCL13抗體（1∶500，beyotime公司，美國）和抗大鼠NeuN抗體（1∶1 000，Millipore公司，美國），孵育，洗滌，加熒光標記二抗，室溫孵育，洗滌，用50%甘油封片。激光共聚焦熒光顯微鏡（Zeiss，德國）觀察CXCL13在神經元上的表達和小膠質細胞活化情況。

1.4 Western blot檢測 CXCL13和 Iba?1蛋白表達 取L4～6脊髓，加組織裂解液，經冰浴勻漿后抽提總蛋白，用BCA法進行蛋白濃度定量，取上樣蛋白 50 μg（20 μL），經 10%SDS?PAGE 凝膠電泳，轉膜，室溫封閉，加入β?actin（1∶3 000，Chemicon公司，美國）、CXCL13抗體（1∶1 000，beyotime公司，美國）和 Iba?1抗體（1∶1 000，beyotime公司，美國），過夜，TBST洗膜，加二抗（1：5 000，北京中杉金橋公司），室溫孵育，洗膜，曝光。分光密度比值反映CXCL13和Iba?1的蛋白表達。

1.5 RT?PCR法檢測CXCL13和Iba?1的mRNA表達 從組織樣本提取總mRNA。采用反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄為cDNA，遵循PCR引物設計原則，以GAPDH作為內參，引物由上海生物工程公司合成，序列見表1。擴增條件：94℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃30 s，72 ℃ 20 s，共45個循環，72℃延伸10 min。計算CXCL13和Iba?1與內參照GAPDH的比值作為目的基因的相對表達量。

表1 CXCL13、Iba?1和GAPDH引物序列Tab.1 Sequences of CXCL13、Iba?1 and GAPDH primers

1.6 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MWT比較 四組大鼠術前1 h MWT值比較無統計學差異（P＞0.05）；與I組比較，R組、NC組和CX組術后2 h MWT值隨時間增加顯著下降（P＜0.05），至術后24 h時降至最低；與R組、NC組比較，CX組術后6 h MWT值顯著升高（P＜0.05），并持續至術后24 h；R組與NC組MWT值在各對應時間點差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠術后不同時點MWT的比較Tab.2 The comparison of MWT value in various groups of rats（n=5） x ± s，g

2.2 免疫熒光雙標表達情況 免疫熒光顯示：疼痛發生時CXCL13在神經元中出現表達，瑞芬誘發痛覺過敏模型大鼠（R組）脊髓中CXCL13表達升高；CXCL13?siRNA慢病毒脊髓注射后（CX組）CX?CL13的表達明顯減少；R組脊髓小膠質細胞明顯活化，CX組其活化則明顯減少。見圖1。

圖1 CXCL13在各組大鼠脊髓中的表達分布Fig.1 The expression distribution of CXCL13 in the spinal cord of various groups of rats

2.3 CXCL13和Iba?1蛋白表達及mRNA表達情況 與I組比較，R組、NC組的CXCL13和Iba?1蛋白表達及mRNA表達水平明顯上調（P＜0.05）；與R組、NC組比較，CX組的CXCL13和Iba?1蛋白表達及mRNA表達水平顯著下調（P＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠脊髓CXCL13、Iba?1蛋白表達的比較Fig.2 The comparison of expression of CXCL13 and Iba?1 protein in the spinal cord of various groups of rats（n=5，x ± s）

表3 各組大鼠脊髓CXCL13、Iba?1的mRNA表達的比較Tab.3 Comparison of mRNA expression of CXCL13 and iba?1 in the spinal cord of various groups of rats（n=5） ± s

表3 各組大鼠脊髓CXCL13、Iba?1的mRNA表達的比較Tab.3 Comparison of mRNA expression of CXCL13 and iba?1 in the spinal cord of various groups of rats（n=5） ± s

注：與I組比較，aP ＜0.05；與R組、NC組比較，bP＜0.05

組別I組R組NC組CX組F值P值CXCL13 1.20±0.20 1.70±0.16a 1.72±0.22a 0.36±0.11 64.955 0.000 Iba?1 1.54±0.11 2.54±0.18 2.58±0.26 2.00±0.16 35.300 0.000

3 討論

圍術期使用阿片藥物可以加重術后痛覺過敏，約有20%的患者術后劇痛難以控制，導致術后并發癥和死亡率的增加，部分患者將發展為術后慢性病理性疼痛，從而嚴重影響患者日后的生存質量［6］。

本實驗中注射瑞芬太尼后出現疼痛靈敏性增高，持續泵注瑞芬太尼后2 h出現疼痛閾值降低，于24 h達到高峰，這與臨床上瑞芬太尼誘發痛覺過敏始于麻醉蘇醒后2 h，并于24～48 h達到高峰的研究基本一致［7］。

神經炎癥反應的主要機制是炎癥介質，包括促炎細胞因子和趨化因子，增強了外周神經系統和中樞神經系統不同區域的痛覺信號［8］。越來越多的研究發現脊髓趨化因子在神經損傷后慢性疼痛進展中的作用［9-10］。CXCL13在裸鼠脊髓神經損傷后表達增高［11］；并且CXCL13已經被證實涉及骨癌痛以及嗎啡的鎮痛耐受機制［12］。本研究發現切口痛組大鼠脊髓中CXCL13產生表達，并在瑞芬太尼誘導疼痛過敏組的表達被上調；BAGAEVA等［13］的研究也表明，CXCL13在健康的中樞神經系統中無表達，但在病理條件下的腦和脊髓中表達升高。在鞘內注射CXCL13?siRNA慢病毒后大鼠的機械痛域值顯著增高，大鼠對疼痛耐受程度增強。這些結果表明CXCL13可能參與了瑞芬太尼誘導痛覺過敏。

阿片類藥物嗎啡引起的鎮痛耐受和痛覺過敏中也發現了脊髓膠質細胞的激活［14］。本研究在瑞芬太尼誘導疼痛過敏模型中CXCL13在脊髓膠質細胞中表達較切口痛模型組增多，而在CXCL13?siRNA組表達減少。這提示CXCL13可能通過激活脊髓膠質細胞參與瑞芬太尼誘導的痛覺過敏。

為了進一步證實脊髓膠質細胞的激活是否參與了瑞芬太尼誘導的痛覺過敏，本研究檢測了小膠質細胞特異性標記物Iba?1的表達，發現在瑞芬太尼誘導的痛覺過敏大鼠脊髓小膠質細胞特異性標記物Iba?1表達較切口痛模型組增高，但在鞘內注射CXCL13?siRNA慢病毒后Iba?1表達顯著降低，表明CXCLl3的表達和小膠質細胞的活化具有同步性，這證實了CXCL13對小膠質細胞的活化是調節瑞芬太尼誘導痛覺過敏的重要環節。其作用機制可能是瑞芬太尼誘發疼痛過敏過程中神經元通過免疫反應調控小膠質細胞的活性，小膠質細胞釋放的趨化因子又進一步激活小膠質細胞，使突觸后脊髓背角痛覺傳遞神經元的敏感性和反應性增強，引起中樞敏化，導致慢性疼痛。

綜上所述，CXCL13可能通過小膠質細胞的激活參與了瑞芬太尼誘發痛覺過敏，抑制CXCL13能夠有效抑制瑞芬太尼誘導痛覺過敏的發生。因此，CXCL13可能成為治療瑞芬太尼誘導痛覺過敏的有效靶點。