全內置式可膨脹型生物涂層脊柱前路內固定系統體外細胞毒性及肌肉植入試驗

黃學良 朱雙芳 林雨聰 周初松

南方醫科大學珠江醫院（廣州 510282）

胸腰椎后路減壓內固定術是治療脊柱疾病常見的手術方式，可實現脊柱的360°環形減壓、前方支撐、重建脊柱穩定性，也是脊柱外科醫師最為熟悉的手術入路［1］。但對于嚴重的胸腰椎爆裂性骨折、椎體腫瘤等疾病，胸腰椎前路手術具有暴露充分、減壓徹底、固定牢固等優勢［2］。目前臨床上常用的前路內固定系統有很多，各有優缺點。作者自主研發的全內置式可膨脹型生物涂層脊柱前路內固定系統（圖1）由鈦合金和表面羥基磷灰石涂層制成，具有全內置、可膨脹性等特點，在前期研究中已證明其具有良好的生物力學性能，可重建脊柱穩定性。本研究根據醫療器械生物學評價中的相關標準［3］，采用體外細胞毒性試驗和肌肉植入后局部反應試驗來評價此內固定系統在這兩方面的生物安全性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級8周齡SD大鼠12只，雌雄不限，體質量180～200 g，由南方醫科大學動物實驗中心提供。

1.2 主要材料、儀器及浸提液的制備 全內置式可膨脹型生物涂層脊柱前路內固定螺釘（由北京富樂公司生產，并由北京航空航天大學進行螺釘表面羥基磷灰石涂層）；L929小鼠成纖維細胞、胎牛血清、DMEM培養基、5%DMSO（二甲基亞砜）、MTT溶液；倒置相差顯微鏡、超凈工作臺、CO2細胞培養箱。浸提液的制備：以含10%新生牛血清的DMEM培養液為浸提介質，浸提比為0.2 g/mL，在（37±1）℃的CO2細胞培養箱浸提（72±2）h獲取浸提液。

1.3 實驗方法

1.3.1 體外細胞毒性試驗 實驗組（內固定材料在浸提液濃度為100%、75%、50%、25%時分別配制）；空白對照組（浸提介質）；陰性對照（密度聚乙烯）；陽性對照（5%DMSO）。將培養48～72 h的細胞用胰蛋白酶消化，加入DMEM培養液稀釋成密度為（2.5×104）個/mL懸液，分為7組，將細胞懸液接種至3塊96孔板中，每組每塊板各6孔，每孔100 μL，將其放入CO2培養箱中培養24 h。棄去各96孔板中的原培養液，磷酸鹽緩沖液清洗2遍，加入相應的浸提液100 μL，于第3、5天更換1次浸提液。3塊96孔板分別培養1、3、5天后，棄去原培養液，每孔加入MTT溶液 20 μL，繼續培養4 h。去除孔內液體，加入150 μL DMSO后，震蕩10 min，在酶標儀490 nm波長下測定其吸光度，計算相對增殖率（RGR）。RGR=（吸光度平均值/空白對照組吸光度平均值）×100%。細胞毒性分級如表1。

圖1 全內置式可膨脹型生物涂層脊柱前路內固定系統的外觀照Fig.1 Appearance of the built?in expandable bio?coating anterior spinal fixation system

表1 細胞毒性分級Tab.1 Cytotoxicity grades

1.3.2 肌肉植入試驗 SD大鼠12只，用3%戊巴比妥鈉溶液進行腹腔注射麻醉后，俯臥固定，背部備皮、消毒。切開大鼠背部正中皮膚，鈍性分離肌肉，在大鼠脊柱兩側約1 cm處各分離成1個肌腔隙，將1個被測內固定材料（高8 mm，直徑3 mm圓柱體）植入右側，左側切開但不植入，作為空白對照組，生理鹽水沖洗切口并逐層縫合。術后連續3 d肌注青霉素，觀察大鼠活動及切口情況。分別于術后1、4、12、26周取材，每組3只。原切口切開，先行大體觀察，再取包含材料的肌肉組織及對側肌肉組織行切片固定，常規蘇木精-伊紅染色（HE染色），在光學顯微鏡下觀察組織反應情況。按照GB/T16886.6?1997中的組織反應分級方法分級。見表2。

評定標準（陰性對照樣品應符合此標準）：植入7 d：炎癥細胞反應程度≤Ⅳ級，囊壁形成0級；植入15 d：炎癥細胞反應程度≤Ⅲ級，囊壁形成Ⅳ級；植入30 d：炎癥細胞反應程度≤Ⅱ級，囊壁形成Ⅱ級；植入60 d：炎癥細胞反應程度≤Ⅰ級，囊壁形成Ⅱ級；植入90 d：炎癥細胞反應程度≤Ⅰ級，囊壁形成Ⅰ級；植入180、360 d：炎癥細胞反應程度I級，囊壁形成Ⅰ級。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 體外細胞毒性試驗 光學顯微鏡下可見空白對照組、陰性對照組及各材料浸提液組的細胞形態正常，以長梭形或多角形為主，貼壁生長良好。陽性對照組細胞形態多呈圓形，明顯可見細胞溶解，貼壁生長差。根據各組RCG值，各材料浸提液細胞毒性分級為0～1級之間，無明顯細胞毒性，各材料浸提液組在1、3、5 d的RCG值兩兩比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；各材料浸提液組在各個時間段的RCG值與空白對照組和陰性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；而各材料浸提液組、空白對照組以及陰性對照組在各個時間段的RCG值與陽性對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3、圖2。

表2 組織反應分級Tab.2 Tissue reaction grades

表3 各組RCG和細胞毒性分級Tab.3 RCG and cytotoxic grades of each group

2.2 肌肉植入試驗 12只SD大鼠均正常存活至試驗結束，切口一期愈合。術后1周，切口腫脹消退，材料與周圍組織結合不緊密，未見炎性滲出或壞死組織，鏡下觀察可見材料周圍組織有以中性粒細為主的炎癥反應，無纖維囊形成，炎癥細胞反應Ⅳ級，囊壁形成0級，對側空白對照組肌肉切開部分與周圍組織無明顯差異，鏡下亦可見炎性細胞浸潤。術后4周，材料與周圍組織結合稍緊密，鏡下見炎性細胞明顯減少，有成纖維細胞增殖，形成厚薄不一的纖維囊腔，炎癥細胞反應Ⅱ級，囊壁形成Ⅱ級。術后12周，材料與周圍組織結合緊密，鏡下未見明顯炎性細胞，材料周圍形成完整較均一的纖維囊腔，炎癥細胞反應Ⅰ級，囊壁形成Ⅰ級。術后26周，肌肉組織完全包裹植入材料，鏡下未見炎癥反應，纖維囊腔完整，炎癥細胞反應Ⅰ級，囊壁形成Ⅰ級。術后4、12、26周空白對照組肌肉組織與周圍組織無明顯差異，鏡下無明顯炎性反應或囊腔形成（表4、圖3）。

圖2 各組細胞在細胞毒性試驗中的光鏡下觀察結果Fig.2 The results of each groups in cell toxicity test

表4 各組組織反應分級Tab.4 Tissue reaction grades of each group

圖3 被測材料植入大鼠肌肉后局部反應試驗的光鏡下觀察結果（HE染色×100）Fig.3 The results of the local reaction test of rat muscle implantation（HE staining × 100）

3 討論

全內置式可膨脹型生物涂層脊柱前路內固定系統由可膨脹的釘體、內芯、連接棒和螺帽組成，通過內芯的擰入，可實現釘體的膨脹［4］。在植入過程中，將螺釘及連接棒完全植入椎體及椎間隙中，實現該內固定系統的全內置，減少了釘棒對周圍臟器、血管等組織的干擾。前期研究中，通過與Kaneda系統、Z?Plate系統的比較，發現三組內固定系統都可重建胸腰椎的即刻穩定性，具有良好的生物力學性能［5］。全內置式可膨脹型生物涂層脊柱前路內固定系統由鈦合金基體及表面羥基磷灰石涂層組成，其中鈦合金為鈦鋁合金。鋁元素是人體的一種微量元素，如果體內殘留過量的鋁可引起阿爾茲海默病、骨軟化癥等疾病［6-7］。羥基磷灰石的化學成分與人體骨骼和牙齒中的礦物質組成相似度極高，是脊椎動物骨組織和牙齒重要的無機組成部分。羥基磷灰石在植入生物體后可與骨細胞在短期內形成化學鍵合，且具有誘導骨細胞長入涂層間隙的特點。另外，羥基磷灰石涂層還可抑制鈦合金釋放金屬離子，是一種具有優良生物活性的醫用材料［8-9］。然而，由于其機械強度不高、脆性大等特點限制了其在人體承重部位的應用［10］。本研究中的全內置式可膨脹型生物涂層脊柱前路內固定系統由鈦合金和羥基磷灰石涂層組成，二者取長補短，既可發揮鈦合金良好的機械性能的優勢，又可發揮羥基磷灰石良好生物相容性的特點，有效提高了植入物的綜合性能，且對成骨細胞、破骨細胞不具有毒性作用［7］。為進一步評價該內固定系統的生物相容性，本研究根據醫療器械生物學評價的相關標準來檢測該內固定系統在細胞毒性和肌肉植入后局部反應方面的安全性。

體外細胞毒性試驗是通過模擬細胞生存的環境，觀察材料浸提液對細胞生長、代謝及增殖的影響，進而評價材料生物相容性的一種有效而快速的方法［11-12］。L929小鼠成纖維細胞具有增殖能力強、傳代穩定、對生長環境敏感等特點，被美國質量標準協會推薦為體外細胞毒性試驗中的標準細胞［13］。試驗采用MTT比色法的原理在于MTT被活細胞內線粒體脫氫酶還原成藍紫色甲臜結晶并沉積，DMSO可將其溶解成溶液，在酶標儀490 nm波長下測定其吸光度，甲臜結晶數量與存活細胞數成正比，因此可通過吸光度值反映細胞的生長情況［14-15］。本研究中，通過觀察第1、3、5天各組細胞的形態和測定其吸光度值可發現，25%、50%、75%、100%四組不同濃度材料浸提液細胞形態正常，增殖良好，吸光度值在93.74%～103.38%之間，細胞毒性分級為0～1級，與空白對照組、陰性對照組無明顯差異。而在各個時間點陽性對照組細胞形態大多呈圓形，貼壁生長較少，可見明顯細胞溶解現象，其吸光度值在35.67%～48.47%之間，細胞毒性分級為3級。因此本研究中被測材料無細胞毒性。

植入后局部反應試驗是將被測材料植入到活體動物某一部位組織內，通過在肉眼和顯微鏡觀察水平上評價材料植入后周圍組織局部反應的試驗方法。本試驗將被測的內固定材料植入大鼠背部脊柱旁一側肌肉腔隙中，以對側肌肉為空白組，通過植入術后1、4、12、26周術區肌肉的大體觀察和顯微鏡下觀察來評價被測材料的植入后局部反應。由試驗結果我們可知，植入術后試驗大鼠一般情況良好，未發生死亡、術區感染等不良并發癥。術后1周，被測材料及空白對照周圍肌肉組織可見大量炎性細胞浸潤，考慮由材料局部刺激和術后應激反應引起。術后4、12、26周植入材料周圍炎性細胞逐漸消失，且逐漸形成穩定的纖維包裹，而空白對照組肌肉組織與其周圍肌肉組織在大體上和顯微鏡下觀察未見明顯異常。說明被測材料隨著植入時間的延長，與周圍肌肉組織趨于穩定狀態。未發生壞死或炎癥反應，提示被測材料對周圍肌肉組織無毒性，植入后局部反應良好。

綜上所述，全內置式可膨脹型生物涂層脊柱前路內固定系統無細胞毒性，植入后對周圍肌肉組織無刺激反應。該內固定材料符合作為植入性的醫用生物材料在體外細胞毒性試驗、植入后局部反應試驗的相關標準。