鉻和鎂聯合補充對糖耐量異常患者miRNA差異表達的研究

張方華 許愛梅 李盈 王曄 高珊 姚民秀

青島大學醫學院第二附屬醫院1內分泌科；2中心實驗室（山東青島 266042）

糖尿病是世界范圍內發病率和病死率最高的疾病之一。2017年全國慢性非傳染性疾病預防控制中心發布的調查顯示我國糖尿病患病率達10.9%，糖尿病前期患病率為35.7%［1］。糖尿病在世界范圍內呈爆發性增長，糖尿病及糖尿病前期的防治刻不容緩。Cr3+是維持正常葡萄糖、胰島素和脂肪代謝所必需的微量元素。鉻攝入量不足可以增加患糖尿病的危險性。鎂是細胞內含量最豐富的第二大陽離子，作為高能磷酸化代謝途徑酶的必需輔助因子參與能量代謝、蛋白合成和調節細胞膜的葡萄糖轉運。微小RNA（microRNA，miRNA）是長度約為22個核苷酸的短鏈非編碼RNA，主要是通過轉錄抑制作用或者mRNA的降解作用，導致沉默其靶基因的表達，從而實現其對靶基因的表達調控。研究表明，微小RNA可以通過其對靶基因的調控，影響糖耐量［2］。筆者前期的研究表明，補充鉻、鎂可降低IGT患者血糖，但具體機制不清。本研究通過高通量測序技術（next generation sequencing，NGS）探討Cr3+和Mg2+聯合補充對糖耐量異常患者循環miRNA表達的影響，篩查表達差異miRNA，探討在糖尿病前期通過微量元素的補充逆轉疾病進程的可能的分子機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取青島大學第二臨床醫學院（青島市中心醫院）2015年1月至2015年12月期間45～59歲的IGT者（符合1999年WHO診斷標準），排除高鎂血癥、惡性腫瘤及冠心病患者；為治療疾病而服用各種藥物者。本研究經青島大學第二臨床醫學院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。自愿參加并簽訂知情同意書者作為研究對象。本研究分為3組，分別是年齡相匹配的正常對照組（10人）、安慰劑對照組（60人）、鉻（120 μg/d）+鎂（200 mg/d）干預組（60人），干預時間為3個月。

1.2 實驗方法 干預前后測定入組患者的空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）、負荷后2 h血糖（2 hours post glucose?load，2 h PG）、空腹胰島素（fasting insulin，Fins）、血脂水平。按照常規方法進行血壓、體重、身高及腰圍、臀圍的測量。計算體重指數（body mass index，BMI=體重/身高2）。計算腰臀比（waist and hip ratio，WHR=腰圍/臀圍）。血糖測定采用葡糖糖氧化酶法，電化學發光法測定Fins，全自動生化分析儀檢測血脂水平。計算胰島素抵抗指數（HOMA?IR=Fins X FPG/22.5）。

1.3 miRNA測序 循環miRNA的提取采用美國Qiagen公司的miRNeasy血清/血漿提取試劑盒。采用NGS技術，檢測3組人群循環miRNA的表達。

1.4 熒光定量PCR（qPCR） miRNA的qPCR引物購于廣州市銳博生物科技有限公司（ribobio）。采用SYBR法。采用2?ddCT法進行數據分析，內參基因為miR?191?5p和miR?16?5p。

1.5 miR?182?5p和miR?96?5p功能富集分析 上述預測出的共同靶基因進行gene ontology（GO）與Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）信號通路分析，采用的軟件為美國Arraystar公司的分析軟件。

1.6 統計學方法 采用GraphPad軟件，qPCR的結果以±s表示。臨床數據采用±s的形式表示。應用非配對t檢驗及單因素方差分析進行比較。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 受試者的臨床特征 受試者OGTT均符合糖耐量異常診斷標準：FPG≥6.1 mmol/L～＜7.0 mmol/L，2 h PG≥ 7.8 mmol/L～＜11.1 mmol/L。共入組130人，其中正常對照組10人、安慰劑對照組60人、鉻鎂干預組60人。脫落2人，其中鉻鎂干預組1例失訪，對照組1例發現肺部惡性腫瘤退出。三組患者年齡匹配（P＞0.05）。入組前對照組、鉻鎂干預組FBG、2hPG、Fins等均無統計學差異（表1）。干預3個月后，鉻鎂干預組FBG、2 h PG、HOMA?IR均較對照組降低，而兩組BMI、WHR、Fins及血脂無統計學差異。見表2。

表1 所有入選受試者入組時一般資料Tab.1 General information of all selected subjects before the intervention ±s

表1 所有入選受試者入組時一般資料Tab.1 General information of all selected subjects before the intervention ±s

組別年齡（歲）性別男/女（%）BMI（kg/m2）FPG（mmol/L）2hPG（mmol/L）Fins（uIU/mL）HOMA?IR TG（mmol/L）TC（mmol/L）LDL?c（mmol/L）HDL?c（mmol/L）WHR正常對照組（n=10）52.89±3.14 4/6（40%）23.75±3.13 4.71±0.54 6.28±0.13 7.40±3.86 1.59±0.81 1.35±1.12 5.02±0.67 2.68±0.78 1.46±0.41 0.82±0.05安慰劑對照組（n=60）52.67±2.65 23/26（38%）24.08±2.51 5.62±0.67 9.46±0.68 13.51±8.03 3.36±2.46 1.96±0.61 5.32±1.02 3.24±0.79 1.30±0.39 0.88±0.06鉻鎂干預組（n=60）53.01±3.11 24/25（40%）24.16±3.08 5.78±0.66 9.47±0.78 13.40±8.17 3.44±1.91 2.01±0.68 5.37±0.97 3.19±1.28 1.29±0.43 0.89±0.06

2.2 miRNA的差異表達 提取血漿miRNA后，應用Illumina測序技術進行測序。在3組血漿樣本中，共檢測得到了263個miRNA可與人類的參比前體miRNA相匹配。在這些miRNA中，得到了6個差異表達的循環miRNA，分別為miR?182?5p、miR?96?5、miR?27b、miR?21、miR?379和miR?143，在安慰劑對照組、鉻鎂干預組差異有顯著性，如表3所示。

2.3 qPCR的結果 為了驗證Illumina測序的結果，筆者對上述的6個差異表達的循環miRNA，miR?182?5p、miR?96?5p、miR?27b、miR?21、miR?379和miR?143，在3組樣本中進行了qPCR的驗證。結果表明，僅有miR?182?5p、miR?96?5p和miR?27b的表達趨勢與測序結果相同，驗證了測序結果。結果如圖1所示。

2.4 miR?182?5p與miR?96?5p的功能富集分析miR?182?5p靶基因的功能富集分析發現與214個GO條目有關，這214個條目可以分為54個與分子功能相關，67個與細胞組份相關，93個與生物學過程相關。信號通路分析表明，與之相關的信號通路是葡萄糖結合通路（圖2）。miR?96?5p靶基因的功能富集分析發現與184個GO條目有關，這184個條目可以分為41個與分子功能相關，59個與細胞組份相關，84個與生物學過程相關。信號通路分析表明，與之相關的信號通路是phosphati?dylinositol signaling pathway（磷脂酰肌醇信號通路）通路（圖3）。

表2 干預前后各臨床指標變化Tab.2 Changes of clinical data before and after intervention ±s

表2 干預前后各臨床指標變化Tab.2 Changes of clinical data before and after intervention ±s

注：與安慰劑對照組相比，*P＜0.05

組別安慰劑對照組鉻鎂干預組t值P值例數59 59 FBG（mmol/L）干預前5.62±0.67 5.78±0.66 1.30 0.19干預后5.57±1.35 5.01±1.52*2.11 0.03 2 h PG（mmol/L）干預前9.46±0.68 9.47±0.78 1.26 0.20干預后9.14±1.78 7.76±2.57*3.39 0.001 Fins（uIU/mL）干預前13.51±8.03 13.40±8.17 0.07 0.91干預后12.49±6.37 12.67±5.41 0.16 0.86組別安慰劑對照組鉻鎂干預組t值P值例數59 59 HOMA?IR干預前3.36±2.46 3.44±1.91 0.19 0.84干預后3.11±2.23 2.32±1.83*2.11 0.03 WHR干預前0.88±0.06 0.89±0.06 0.90 0.36干預后0.86±0.07 0.84±0.08 3.39 0.001 BMI（kg/m2）干預前24.08±2.51 24.16±3.08 0.15 0.87干預后23.51±2.55 24.11±2.87 1.20 0.23組別安慰劑對照組鉻鎂干預組t值P值例數59 59 TG（mmol/L）干預前1.96±0.61 2.01±0.68 0.42 0.67干預后1.86±1.02 1.57±0.84 1.68 0.09 TC（mmol/L）干預前5.32±1.02 5.37±0.97 0.27 0.78干預后4.91±0.87 4.84±0.81 0.45 0.65 LDL?c（mmol/L）干預前3.24±0.79 3.19±1.28 0.25 0.78干預后3.13±0.82 3.01±0.75 0.82 0.40 HDL?c（mmol/L）干預前1.30±0.39 1.29±0.43 0.13 0.88干預后1.46±0.31 1.42±0.53 0.50 0.61

表3 NGS測序結果Tab.3 NGS sequencing results

3 討論

圖1 定量PCR的結果Fig.1 Results of quantitative PCR

糖尿病嚴重影響患者生存質量，甚至危及生命，其病死率大于艾滋病、結核病和瘧疾病死率的總和，大約每6秒就有一個糖尿病患者死亡。從早期的代謝異常到糖尿病的過渡，即從空腹血糖受損（impaired fasting glucose，IFG）和IGT到臨床糖尿病可能需要很多年；然而，大多數IFG、IGT人群最終發展為糖尿病。IFG和IGT代表糖耐量正常人群與糖尿病之間的中間狀態。

圖2 miR?182?5p的功能富集分析Fig.2 miR?182?5p′s functional enrichment analysis

圖3 miR?96?5p的功能富集分析Fig.3 miR?96?5p′s functional enrichment analysis

鉻（三價）和鎂在能量物質代謝過程中發揮關鍵作用，是維持正常葡萄糖、胰島素和脂肪代謝所必需的微量元素，其與胰島素抵抗的關系一直以來是研究的熱點。鉻是維持正常葡萄糖、胰島素和脂肪代謝所必需的微量元素。以往的研究發現，鉻可以通過增強胰島素與細胞結合、增加胰島素受體數量、提高胰島β細胞敏感性、增強胰島素內攝和激活胰島素受體激酶來增加胰島素敏感性。鉻（三價）在碳水化合物、脂類和蛋白質代謝中起著重要作用；然而，其在分子水平上的作用機制尚不完全清楚。KROL等［3］研究發現Cr3+可以改善由IL?6、TNF?α、C反應蛋白、單核細胞趨化蛋白-1以及細胞間黏附分子1（ICAM?1）誘導的糖尿病大鼠的炎癥反應。鎂是很多能量代謝酶的輔酶，鎂缺乏參與了胰島素抵抗的形成。本研究發現補充微量元素鉻鎂后，IGT患者血糖降低，胰島素抵抗得以改善。

有研究表明，miRNA通過作用于多個通路促進胰島素分泌或調節胰島素抵抗，其可能成為治療糖尿病的新靶點。李偉等［4］發現，妊娠糖尿病患者胎盤組織miRNA表達異常，且與胰島素信號通路多個靶點有關。目前有很多報道是關于潛在的miRNA作為2型糖尿病的生物標志物的研究。ZAMPETAKI等［5］報道了在患者發生2型糖尿病前的數年，其血漿miR?15a，miR?28?3p，miR?29b，miR?126和miR?223的表達已發生改變。另外的一項研究發現了7種血清來源的miRNAs（miR?9，miR?29a，miR?30d，miR?34a，miR?124a，miR?146a，and miR?375），與NGT的人群相比，這7種血清來源的miRNAs的表達在T2DM患者人群顯著升高［6］。

本研究中發現微量元素鉻鎂聯合補充降低血糖，改善胰島素抵抗的同時，可增加血漿中miR?182?5p和miR?96?5p的表達。miR?182?5p和miR?96?5p屬于miR?183/96/182基因簇，2003年首先在視網膜中被發現，以后又陸續在成骨細胞、淋巴細胞、視網膜和內耳組織中被相繼發現。miR?182?5p可能通過調控胰島素的合成參與糖尿病發生。在MIN6胰島β細胞和原代胰島細胞中敲除miR?182后，將導致胰島素合成減少，其機制可能是敲除miR?182后胰島素基因的轉錄抑制因子Bhlhe22（basic helix?loophelix family，member 22）表達上調，胰島素基因啟動子轉錄活性降低。研究表明，miR?182與胰島素抵抗有關，還與胰島素信號通路（IGF?1）相關。miR?182通過調節肌肉葡萄糖的利用從而調控糖代謝的平衡［7］。miR?96通過InsR與IRS?1基因抑制飲食誘導的飽和脂肪酸加重肝臟胰島素抵抗［8］。

綜上所述，聯合補充鉻鎂可降低IGT患者血糖，改善胰島素抵抗。IGT患者miR?182?5p和miR?96?5p表達降低，補充鉻鎂后可使 miR?182?5p和miR?96?5p表達升高。聯合補充微量元素鉻和鎂可能通過增強miR?182?5p和miR?96?5p表達，而改善IGT患者的糖耐量。