睡眠剝奪所致的警覺性受損及其可能機制

王忠 朱囡囡 陳文浩 謝雯

1安徽醫科大學精神醫學中心，安徽省精神衛生中心（合肥 230032）；2安徽醫科大學精神衛生臨床學院，安徽省精神衛生中心（合肥 230022）；3北京大學第六醫院，北京大學精神衛生研究所，衛生部精神衛生學重點實驗室（北京 100191）

睡眠是一種自發、可逆的周期性狀態，人一生約1/3的時間都是在睡眠中度過，當人體處在睡眠狀態時，全身放松，身體的各個器官都能得到很好的休息，是機體復原、信息整合和記憶鞏固的重要環節［1-2］。然而，隨著社會進步、生活節奏的加快、夜生活豐富以及電子網絡等產品的使用，睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）在現代社會尤其是年輕人中已成為普遍存在的現象［3］。一項橫斷面的調查報告［4］指出，70%以上的年輕人每天的睡眠時間都少于推薦的睡眠時間，且至少有60%被定義為睡眠嚴重缺乏。研究［5］表明，良好的睡眠對人體健康特別認知功能的維持極其關鍵，警覺注意力作為認知的一個最基本維度是完成其他高級認知過程的必要條件，也是SD的高敏感指標，其功能的維持受到晝夜節律及持續覺醒時間影響［6］。食欲素-A（Orexin?A）是一種下丘腦特定神經元分泌釋放的神經肽，在飲食攝入和能量代謝穩態調節方面起重要作用，且參與睡眠與覺醒狀態的調控具有促進和維持醒覺的作用［7］。有研究發現，經鼻給予Orexin?A還在改善由SD引起的認知受損方面起重要作用［8］。目前，急性SD普遍存在于制造、醫療服務及運輸等行業，SD導致的大腦警覺性與判斷力減弱以及思考能力下降會導致許多嚴重的安全事故的發生，這也使得長期SD日益成為嚴重的公共衛生問題［9］。本研究通過觀察SD及睡眠恢復（sleep recovery，SR）對人體警覺性節律及血清Orexin?A水平的影響，探究之間潛在的功能聯系，并探討其中可能的機制，為臨床提供可能的生物標志物和治療靶標。

1 對象與方法

1.1 研究對象 （1）納入標準：漢族，年齡在18～25歲之間，男女不限，健康大學生；作息時間規律（上床時間在11：00 pm±30 min；起床時間7：00 am±30 min），每天睡眠時間在7～8 h范圍內；匹茲堡睡眠質量指數總分≤5分，Epworth嗜睡量表≤10分，漢密爾頓抑郁量表（24項）≤7分，漢密爾頓焦慮量表＜7分，蒙特利爾認知評估≥26分；體質指數（body mass index，BMI）正常（18.5≤ BMI＜25）；腰臀比正常（男性 ＜ 0.9；女性 ＜ 0.88）；無煙酒嗜好或其他物質濫用，無飲用茶、咖啡等功能飲料的習慣。

本臨床實驗獲得北京大學第六醫院倫理委員會批準，實驗開始前向受試者詳細說明實驗流程及注意事項，所有受試者均自愿參加本實驗并簽署知情同意書。

（2）通過上述標準成功納入28名健康大學生，因中途退出及樣本缺失等原因，最終納入分析的有21名（19～24歲）被試，其中男11人，都經過嚴格的問卷評估及臨床篩查，排除一切可能存在的精神心理、睡眠疾病以及作息不規律、熬夜等不良生活習慣，此外存在癲癇、糖尿病等SD禁忌疾病的被試也被排除在外。

1.2 方法

1.2.1 實驗過程 正式實驗之前，被試者被要求進行1周的體動記錄儀（wGT3x?BT，Actigraph，美國佛羅里達州）監測及睡眠日記記錄，用以評估其日常活動及作息習慣。且被試會被提前到實驗室適應1 d（d1），隨后將被要求在嚴格控制的實驗室條件下保持連續40 h的清醒狀態（7：00 am～11：00 pm：自由活動但限制劇烈運動；11：00 pm～7：00 am：半仰臥式），期間可以進行閱讀、看視頻等活動，在40 h SD期間受試者需要一直配戴體動記錄儀記錄活動狀況，如果因受試者未能保持40 h清醒，將不能繼續進行剩下的研究，緊接著是8 h的SR。在SD過程中，被試被要求平均每2個小時進行1次精神運動警覺性測試（psychomotor vigilance task，PVT）。在SD開始，SD 24 h及SR后的3個清晨8點進行3次靜脈采血及匹配的PVT測試，分別對應的是SD開始，SD 24 h及SR 8 h后3個時間點。

1.2.2 實驗方法 （1）本研究使用的是基于Eprime 1.0軟件編制的PVT任務，在SD期間，被試會被安排在一個安靜、舒適的環境中進行測試，指導語保持一致，任務開始屏幕上會有一個紅色方框，提示被試注意屏幕中央，接著會在隨機時間間隔下（1 000～9 000 ms）出現一個黃色的計時器，數字由0開始以毫秒（ms）為單位遞增，要求被試者盡可能快地按鼠標左鍵反應，時限為30 s，超時會自動進入下一試次，按鍵后計時器會停下來，方框變成黃色，被試者可以看到自己的反應時間（reac?tion time，RT），時間呈現2 s后消失，方框再次變成紅色，下一試次開始，整個任務共計90試次，整個任務大概持續10 min，測試結束后會得到每個被試每一試次的RT，當RT≥500 ms時被定義為走神，當RT≤150 ms被定義為一次錯誤反應。（2）使用酶聯免疫吸附測定法（enzyme linked immuno?sorbent assay，ELISA）測定血清中Orexin?A的濃度，Orexin?A ELISA試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，檢測靈敏度約是37.50 pg/mL。

1.3 統計學方法 所有數據分析均使用基于Windows的IBM SPSS 20.0軟件進行，連續變量均以±s形式表示。使用Kolmogorov?Smirnov和Levene檢驗分別進行正態性和方差齊性檢驗。采用重復測量方差分析（ANOVA）分析PVT參數及血清Orexin?A水平，采用Pearson相關分析SD前后PVT參數及血清學參數變化（Δ）之間的相關性（Δ被定義為在SD 24 h后的參數減去相對應的基線參數），P＜0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 人口學及臨床一般資料 所有被試的年齡、BMI等人口學信息以及一般臨床資料見表1，被試年齡在19～24歲之間，且都有良好的睡眠作息習慣（體動記錄儀記錄每天平均上床時間：11：01 pm；平均起床時間：7：18 am），沒有任何精神軀體疾病史以及任何SD禁忌疾病。

2.2 SD對警覺性的影響 重復測量ANOVA發現，SD后被試的PVT中位反應時（intermediate RT）及走神次數（lapses）顯著增加（圖1A、B），發現天數因素存在主效應（RT：F1，40=8.05，P=0.007；laps?es：F1，40=15.67，P＜ 0.001），提示與基線（d2）相比，SD第2天（d3）出現顯著的PVT中位反應時及走神次數的增加。進一步標注40 h SD期間每個個體的PVT走神次數，闡明PVT走神次數隨SD時間延長的動態變化（圖1C），結果發現幾乎所有的被試從零點（12：00 am）直到SD結束時，PVT走神次數都顯著增加，提示持續的SD導致警覺性表現的不穩定。為了與血清學指標匹配，分析基線，24 h SD后和SR后8：00 am的PVT數據（圖2A、B），發現PVT的中位反應時（F1.52，30.42=13.85，P＜0.001）及走神次數（F1.43，28.66=13.26，P＜ 0.001）經過SD后3個時間點差異均有統計學意義。多重比較發現，與基線相比，經過24 h的SD，中位反應時及走神次數都顯著增加（intermediate RT：P=0.002；lapses：P=0.001），提示被試警覺性表現顯著受損，且經過8 h SR后（d4）與基線相比差異仍有統計學意義（intermediate RT：P=0.002；lapses：P=0.011）。

表1 人口學信息及臨床一般資料Tab.1 Participant demographics and clinical characteristics（n=21）±s

表1 人口學信息及臨床一般資料Tab.1 Participant demographics and clinical characteristics（n=21）±s

參數年齡（年）性別（男%）BMI（kg/m2）MEQ腰臀比睡眠效率（%）#結果22.33±0.35 11（52.40）21.74±0.44 57.29±1.13 0.80±0.01 86.29±1.12參數PSQI HAMD HAMA ESS FFS總睡眠時間（min）#結果2.67±0.27 1.38±0.33 1.71±0.29 3.67±0.50 5.57±0.54 428.24±7.01

圖1 PVT反映的睡眠剝奪導致的被試警覺性連續變化Fig.1 Effects of sleep deprivation on alertness，reflected by performance on the PVT

2.3 睡眠剝奪對于血清學指標的影響 重復測量ANOVA顯示3個時間點下的Orexin?A水平存在顯著差異（F2，40=3.66，P=0.035；圖2C），多重比較發現與基線相比，24 h SD后，血清Orexin?A水平（P=0.023）顯著升高，且在8 h SR后與基線水相比差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 警覺性變化與Orexin?A變化的關系 為了探索SD相關警覺性變化與血清標志物之間的關系，評估了PVT參數變化和血清Orexin?A濃度變化之間的關系。Pearson相關分析發現：SD后血清Orexin?A水平（ΔOrexin?A）增加與PVT中位RT增加（ΔIntermediate RT）之間呈負相關（r=-0.53，P=0.014；圖2D）。

3 討論

睡眠是生物機體的本能行為之一，對機體具有非常重要的意義，SD是研究睡眠功能與發生機制的重要方法。本實驗利用睡眠醫學常用的SD范式研究急性SD對認知警覺性的影響并進一步探究其可能的機制。眾所周知，一定的警覺性及注意力，對完成復雜的認知過程是極其重要的，是完成其他更高層次認知功能的基礎。此外，機體警覺性也是SD最能持續和顯著影響的認知能力之一［10］。在正常睡眠情況下，健康人在正常清醒時間里警覺性是保持相對穩定的，且只要保證足夠的睡眠，在正常生理節律情況下，警覺性的波動也是微不足道的，且這種波動也只有在十分敏感的指標下才能檢測到。SD期間評價警覺性最常用的方法是PVT［11］。PVT的反應時間（RT）及走神次數等指標對SD或慢性睡眠限制導致的警覺注意力下降非常敏感且檢測效度高、學習效應小，已成為評估SD對認知警覺影響的“金標準”［10］。有研究證明當連續覺醒的時間超過16 h時，大多數人都開始出現RT顯著增加等PVT表現明顯受損的現象，且隨著覺醒時間的持續會繼續惡化［12］。本研究發現，隨著SD時間的延長，人體的警覺性穩態遭受破壞，主要表現為反應時及走神次數都顯著增加，且短期的恢復睡眠不能完全恢復，這就提示人們在急性SD后即使經歷了短暫SR也不應繼續從事對注意警覺性有要求的工作，比如駕駛、登高及高危車床等。但目前關于SD如何去影響這種節律以及其受損的潛在生理機制還不清楚。Orexin-A是一種下丘腦特定神經元分泌釋放的神經肽且可以迅速通過血腦屏障進入到外周血里，在飲食攝入和能量代謝穩態方面起重要作用，且參與睡眠與覺醒狀態的調控具有促進和維持醒覺的作用［8-9］。通過對發作性嗜睡癥的患者的腦組織進行研究發現，相比于正常人，患者下丘腦中食欲素神經元數量明顯減少（85% ～95%）［13］。此外，通過評估正常人及發作性嗜睡癥患者腦脊液Orexin?A溶度發現，相比正常人，患者腦脊液中幾乎無法檢測到Orexin?A，這就提示了食欲素神經元分泌的Orexin?A可能與睡眠覺醒調控有關［14］。近年來，一些研究還發現，Orexin?A在緩解SD引起的認知受損方面也起重要作用［9］。這就提示SD后機體食欲素-A的水平與認知行為學的改變可能存在某種聯系，且SD會導致小鼠相關腦區食欲肽神經元的Orexin釋放及活性的顯著增加［14］。本研究也發現SD后Orexin?A水平顯著增加。此外，已有研究發現食欲肽神經元的數量可以影響警覺性及持續注意力任務表現［15］。本研究發現SD導致的Orexin?A水平的變化與PVT中位反應時變化之間呈負相關，這就提示越高的Orexin?A水平變化會導致越小的PVT中位反應時受損。這可能由于在清醒期間，Orexin合成神經元通常是活躍的，反過來，這些神經元的激活也會增加覺醒［16］，SD導致的持續清醒時間延長，會導致這些神經元的Orexin合成與維持覺醒之間的平衡被破壞，在同等的PVT表現下，越高的Orexin?A分泌變化，提示相應神經元持續覺醒的調節能力越強，警覺性表現越穩定［15］。這一發現可能為后續進一步研究SD導致的認知警覺性受損的機制提供參考。

圖2 睡眠剝奪及睡眠恢復對PVT參數及血清Orexin?A水平的影響及兩者相關性Fig.2 Effects of sleep deprivation and sleep recovery on PVT parameters and serum Orexin?A level and their correlation

綜上所述，本研究通過嚴格控制SD及被試納入的條件，以探究SD/SR對警覺性和血清Orexin?A水平變化的影響及兩者相關性。發現SD會破壞人體正常的警覺性節律，且這種警覺性受損與血清Orexin?A的水平有關，但Orexin?A是如何影響警覺性的表現及其具體神經生物學機制還需要進一步探索。本研究希望能為后續研究SD導致的認知受損和警覺性下降的可能機制提供參考及為臨床可能的SD導致認知受損生物標志物和治療靶標。本研究也存在不足之處：由于實驗條件限制，本研究未能與PVT測試進行匹配靜脈多次采血，進一步深入探究警覺性節律與血清Orexin?A濃度之間的關系。此外，研究的樣本量也太小。本課題組后續將進行外周給予Orexin?A能否緩解SD所致的警覺性受損的大樣本研究來進一步驗證本的實驗發現。