HMGB1?TLR4軸及其下游信號因子在帕金森病患者中的變化及其意義

王國輝 王麗華 秦麗紅 寧樹君 吳佳歡

佳木斯大學附屬第一醫院神經內科（黑龍江佳木斯154002）

帕金森病是中老年常見的神經系統病變疾病，基本病理特征是黑質-紋狀體內多巴胺能神經元變性及功能缺失，臨床表現為靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態的異常［1］，近年來發現神經炎癥在帕金森病的發生發展中有著重要的作用［2-4］。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）作為胞外一種高遷移率族蛋白，不僅在胞外可以啟動/放大炎癥性免疫反應，而且其引發的炎癥反應在腦組織中發揮著重要的作用［5］。尤其是在神經炎癥反應中，HMGB1高表達可以促進星形膠質細胞激活RAGE?MAPK信號，從而促進趨化因子、環氧化酶2和基質金屬蛋白酶9等諸多生物活性分子的表達［6］。研究還發現HMGB1可以引起腦組織IL?6等炎癥因子表達［7］。這一系列神經炎癥性因子的表達可以促進神經細胞的凋亡，促進中樞退行性疾病的發生和進展。本研究主要探討帕金森病患者中HMGB1及其受體Toll樣受體4（TLR4）的表達與帕金森病發生發展的關系，并做一探討，為臨床中帕金森病的研究提供參考和支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2015年6月至2017年6月就診并確診為帕金森的患者120例（PD組），納入標準為：（1）運動緩慢：隨意運動的啟動緩慢、病情進展后，重復性動作的速度及幅度進行性降低；（2）符合以下癥狀之一：肌強直，靜止性震顫（4～6 Hz），姿勢平衡的障礙（非由于原發性的視覺、前庭、小腦及本體感覺功能障礙造成的）。排除標準為：（1）反復腦卒中發作伴隨帕金森病癥的階梯性進展；（2）腦損傷史；（3）在應用精神藥物中出現的癥狀；（4）起病3年后仍表現為單側癥狀的患者；（5）小腦病變體征；（6）Babinski等病理征（+）；（7）CT或者磁共振檢查顯示腦部腫瘤等器質性病變；（8）大劑量左旋多巴治療后無效的患者。入組的帕金森病患者還符合以下輔助診斷的3項及以上：（1）單側起病；（2）靜止性震顫；（3）逐漸進展；（4）癥狀不對稱，起病側較重；（5）左旋多巴有明顯療效（70% ～100%有效）；（6）左旋多巴導致嚴重的異動癥；（7）左旋多巴療效持續5年及以上；（8）病程10年及以上。120例患者根據Hoehn?Yahr分級標準，其中Ⅰ級40例，Ⅱ級35例，Ⅲ級35例，Ⅳ級10例，Ⅴ級0例。選擇同期于我院體檢中心的健康人100例作為對照組。入組時排除感染性疾病、免疫抑制劑、激素使用等。該研究所有患者信息、血液樣本等均獲得患者或家屬知情并同意及倫理委員會批準。

1.2 標本收集及檢測 所有入住帕金森病患者及健康人均禁食12 h后采集外周靜脈血2 mL，室溫下靜置0.5 h后離心20 min，取上層血清，-80℃條件下保存。應用雙抗體夾心酶聯免疫吸附實驗（ELISA）測定血清中HMGB1?TLR4軸及髓樣分化因子（MyD88）、核因子κB（NF?κB）、腫瘤壞死因子α（TNF?α）的表達水平。用酶標儀在450 nm處測定吸光度A，以標準品的濃度為橫坐標，A為縱坐標繪制標準曲線，根據A帶入標準曲線擬合方程式，計算血清樣本中HMGB1和TLR4、MyD88、NF?κB、TNF?α的水平，結果以ng/L表示。

1.3 統計學分析 數據處理采用SPSS 21.0軟件分析，方法采用方差分析（F分析），PD組和對照組的比較采用LSD法，相關性分析采用Pearson相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組研究對象基本資料的對比 帕金森患者120例（PD組）和對照組100例，在年齡組成、性別組成、基礎疾病、吸煙史、體質量等基礎資料比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 患者基礎資料對比Tab.1 Comparison of patients′basic data 例（%）

2.2 兩組研究對象血清中HMGB1和TLR4的表達水平比較 帕金森病患者外周血中HMGB1為（5.96±2.10）ng/L顯著高于對照組（1.30±0.18）ng/L（F=18.32，P＜0.001），帕金森病患者外周血中TLR4為（2.56±0.78）ng/L顯著高于對照組（0.87±0.12）ng/L（F=26.31，P＜ 0.001）。帕金森病患者外周血HMGB1和TLR4表達有一定相關性（r=0.757 8，圖1）。

2.3 帕金森病患者血清HMGB1和TLR4的表達與分期的關系 Ⅰ期帕金森病患者HMGB1表達為（3.53±1.01）ng/L，Ⅱ期表達為（6.41±0.87）ng/L，Ⅲ期表達為（7.16±0.68）ng/L，Ⅳ期表達為（8.44±1.12）ng/L，各分期均顯著高于對照組（t=3.25、5.47、8.36、12.11，均P＜0.001），而Ⅰ期中TLR4為（1.67±0.40）ng/L，Ⅱ期為（2.57±0.51）ng/L，Ⅲ期為（3.11±0.42）ng/L，Ⅳ期為（3.89±0.61）ng/L，各分期均顯著高于對照組（t=3.24、6.54、8.21、10.32，均P＜0.001）。HMGB1和TLR4隨著帕金森病分期的增高，表達顯著增高。見圖2。

圖1 帕金森病患者外周血中HMGB1和TLR4的表達的相關性（n=120）Fig.1 Correlation of expression of HMGB1 and TLR4 in peripheral blood of patients with Parkinson′s disease（n=120）

圖2 帕金森病分期與患者血清中HMGB1和TLR4的表達的關系（n=120）Fig.2 The relationship among the stage of Parkinson′s disease and the expression of HMGB1 and TLR4 in the serum of the patients（n=120）

2.4 帕金森患者者血清HMGB1和TLR4的表達與臨床分型的關系 將120例患者按照臨床表現分為混合型、震顫型和強直型。混合型的帕金森患者臨床表現主要為同時有肢體震顫和肌肉強直的表現；震顫型帕金森患者的臨床表現主要為肢體震顫，肌肉強直不明顯；強直型帕金森患者的臨床表現主要為肌肉的僵硬。組間比較HMGB1和TLR4差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.5 帕金森病患者血清HMGB1和TLR4的表達與藥物治療的關系 120例帕金森病患者均接受多巴胺類藥物及其酶抑制劑的聯合治療，其中83例控制良好，37例藥物控制不佳出現了病情的進展。在對其血清HMGB1和TLR4的表達分析后，藥物控制良好的患者（有效組）HMGB1的表達為（4.25±0.65）ng/L、TLR4的表達為（2.31±0.87）ng/L，而藥物控制不佳的患者（難治組）HMGB1的表達為（6.43±1.14）ng/L、TLR4的表達為（3.10±0.93）ng/L，兩組之間比較差異有統計學意義（F=13.21、15.22；均P＜ 0.001）。

表2 帕金森患者血清HMGB1和TLR4的表達與臨床分型的關系Tab.2 The relationship among the expression of HMGB1 and TLR4 in the serum of Parkinson patients and the clinical typing

2.6 帕金森病患者血清HMGB1和TLR4的表達與病程的關系 120例帕金森患者按照病程分類，其中＜4年為52例，4～8年為46例，＞8年以上為22例。其中病程＜4年的帕金森病患者血清中HMGB1的表達為（3.87±0.85）ng/L，TLR4的表達為（1.85±0.49）ng/L，病程4～8年的患者HMGB1的表達為（5.41±0.76）ng/L，TLR4的表達為（2.52± 0.63）ng/L，病程＞8年的的患者HMGB1的表達為（6.13±1.12）ng/L，TLR4的表達為（3.13±0.86）ng/L，而組間比較HMGB1和TLR4的表達差異有統計學意義（P=0.003、0.001）。

2.7 帕金森病患者血清中HMGB1?TLR4軸下游因子MyD88、NF?κB以及TNF?α的表達 正常健康人中MyD88（518.2 ± 63.4）ng/L、NF?κB（985.3 ±114.6）ng/L以及TNF?α（207.3± 27.4）ng/L的表達顯著高于帕金森病患者MyD88（879.2±85.3）ng/L、NF?κB（1 453.4 ± 184.6）ng/L 以及 TNF?α（415.3 ±46.7）ng/L（F=15.32、22.31、18.32，P=0.000、0.000、0.000）。見圖3。

圖3 帕金森病患者血清中HMGB1?TLR4軸下游因子MyD88、NF?κB以及TNF?α的表達（n=120）Fig.3 Expression of the HMGB1?TLR4 axis downstream factors MyD88，NF?κB，and TNF?α in the serum of patients with Parkinson′s disease（n=120）

3 討論

隨著對HMGB1的深入研究后發現，HMGB1和TLR4介導的炎癥反應與多種疾病有關，有敗血癥、腦膠質瘤等［7-8］。HMBGI?TLR4軸是炎癥反應的中心環節，受損壞的細胞、激活的巨噬細胞等均可以主動/被動釋放HMGB1，釋放后可以通過信號通路誘導TNF?α和IL?6等炎癥因子的分泌，而早期致炎因子及HMGB1本身又可以促進HMGB1的釋放，形成環路后可以放大炎癥反應［9-11］。Toll樣受體TLR4作為細胞表面識別受體，可以識別內源性的HMGB1，TLR4激活后可以募集髓樣分化因子MyD88樣接頭蛋白，而MyD88可以與IL?1等受體相關激酶家族蛋白形成復合物，最終促使核轉錄因子（κB）進入細胞核發揮調控作用［12-14］。誘導帕金森病的外界影響因素很多，這類因素可以損傷人腦組織中星形膠質細胞、小膠質細胞等進而激活釋放 HMGB1［15］，激活的膠質細胞或者神經元通過旁分泌或自分泌激活HMBGI?TLR4信號，在HMGB1參與的神經炎癥研究中發現HMGB1具有促神經炎因子樣作用，腦室內注射HMGB1可以促進小鼠腦組織中TNF?α和IL?6的表達，NF?κB作為HMBGI?TLR4信號的下游因子之一，它可以誘導巨噬細胞中白介素6的表達，由于白介素6是一種多效性促炎因子，在慢性炎癥以及神經炎癥中發揮著重要的作用，而TNF?α通過NF?κB的誘導活化后也可以參與炎癥反應。MyD88通過多種Toll樣受體激活［16-17］，介導白介素6的活化。所以NF?κB、TNF?α、MyD88的表達水平可以反應神經炎癥水平，以及HMBGI?TLR4軸的表達。

在神經炎癥的研究中已經有多項報道稱，炎癥因子的水平和病情的發展具有相關性，帕金森病雖然是一種中樞退行性的疾病，但是在發病機制的報道中也存在星形膠質細胞過度激活、炎癥因子過度釋放等。而據以往的報道，HMGB1?TLR4作為中樞神經炎癥反應的核心信號是否與帕金森病發生發展具有關系則未見報道，所以本研究的結果初步探明了HMBGI?TLR4軸及其下游信號因子在帕金森病的表達異常，從結果來看，隨著病程的進展，分級的提高，HMGB1?TLR4軸表達水平明顯增高。這可能為臨床中帕金森病分級診斷提供一種標志物的參考。但是本研究從臨床角度出發，未進行深入的機制研究，所以HMGB1?TLR4軸促進帕金森并進展的機制尚未被揭示，這也是筆者后續所需要開展的研究。