NCoR和SRC?1在子宮內膜重度不典型增生中的表達及意義

李翠芬 劉燕燕 楊宇峰 霍熾文

東莞市第三人民醫院婦科（廣東東莞523326）

子宮內膜癌是女性常見生殖道惡性腫瘤，約占女性生殖系統惡性腫瘤的25%［1］，其發病歷經子宮內膜增生不伴不典型增生及子宮內膜不典型增生及癌變過程，其中子宮內膜不典型增生則為子宮內膜癌癌前病變常見類型，報道顯示其進展為子宮內膜癌風險高達23%［2］。至今子宮內膜癌仍缺乏敏感性及特異性較高的血清腫瘤標志物，探索研究更多的標志物對于子宮內膜癌及癌前病變的診治有很高的臨床價值［3］。現國內外常用治療子宮內膜不典型增生及局部癌變的藥物為孕激素和促性腺激素釋放激素激動劑，研究發現病變內膜對藥物的反應率達57%～94%。孕激素類的作用機制為減少子宮內膜的雌激素核受體水平；抑制子宮內膜DNA合成；增加雌二醇向雌酮等活性較弱的雌激素轉化。目前認為子宮內膜癌屬激素依賴性腫瘤，雌激素及抗雌激素水平的變化與子宮內膜癌發病存在密切關聯，且子宮內膜不典型增生同樣與子宮內膜長期持續受雌激素刺激有關［4］。施秀等［5］發現雌激素受體（ER）狀態與子宮內膜病變程度有關，同時可反映子宮內膜細胞組織對治療的敏感性，是信號傳導通路是子宮內膜癌防治的關鍵靶點。而核受體共調節蛋白因子則為與該通路密切相關的重要元件，其包括共/輔助激活因子（N?CoA）與共/輔助抑制因子（N?CoR），目前認為核受體共刺激因子（SRCs）異常表達可增強ER調控靶基因轉錄活性，促進子宮內膜癌變。類固醇受體輔活化子?1（SRC?1）則屬于p160家族成員，具備氨酸乙酰化轉移酶活性，可調節轉錄因子與靶基因結合，強化雌激素所誘導細胞增殖能力［6］。但目前國內外尚無報道圍繞子宮內膜不典型增生患者N?CoR、SRC?1表達水平的變化展開。基于此，為探討N?CoR、SRC?1在子宮內膜重度不典型增生患者中的表達及其意義，現對收治的60例子宮內膜重度不典型增生患者及30子宮內膜正常對象進行了研究分析，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月至2017年2月我院收治的60例子宮內膜重度不典型增生患者作為觀察組。納入標準：均經病理檢查證實為子宮內膜重度不典型增生；強烈要求保留子宮，自愿要求進行藥物治療；均為本市常住居民，可完成隨訪調查；知情且已簽署研究同意書。排除標準：合并嚴重心肝腎肺疾病者；合并自身免疫性疾病者；合并急慢性感染者；合并嚴重精神障礙者；合并高血壓或糖尿病者；不能配合隨訪者。選擇同期來我院行內膜活檢的30例既往無子宮內膜病變的正常健康人作為對照組。對照組既往均無子宮內膜增厚及病變表現，月經規律，來我院行全身體檢，同意行子宮內膜活檢，于月經干凈3天來院行宮腔鏡檢查及子宮內膜活檢。觀察組年齡31～50歲，平均（43.6±3.1）歲；孕次0～6次，平均（2.6±1.2）次；產次0～4次，平均（1.6± 0.9）次。對照組年齡32～49歲，平均（42.9± 3.5）歲；孕次0～7次，平均（2.4±1.1）次；產次 0～3次，平均（1.7±0.6）次。

1.2 主要試劑與儀器 兔抗人NCoR多克隆抗體（購自Abcam公司）；兔抗人SRC?1多克隆抗體［購自Cell Signaling Technology，Inc（CST）公司］；兔抗人孕激素受體（PR）多克隆抗體、ER多克隆抗體（均購自Abcam公司）；生物素標記羊兔二抗、SP免疫組化試劑盒［購自Cell Signaling Technology，Inc（CST）公司］；逆轉錄?聚合酶鏈反應（RT?PCR）試劑盒、β?actin抗體、Trizol試劑盒（均購自Abcam公司）；NCoR、SRC?1引物（生工生物工程有限公司）。BX?50全自動顯像照相系統、顯微鏡（日本Olympus公司）；電熱恒溫水浴箱（上海醫療器械七廠）；格蘭仕微波爐（廣東格蘭仕廠）；AS325轉輪式切片機（英國Shandon公司），TN?100B型托盤式扭力天平（上海第二天平儀器廠）；PCR儀（美國伯樂公司）。

1.3 實驗方法 （1）免疫組化SP法。兩組均行子宮內膜活檢，留取子宮內膜組織，石蠟包埋，切片機連續切片，厚度4～6 μm，切片水浴，晾曬，烘干備用，常規脫蠟，水化，浸于二甲苯，5 min×3次，切片置入無水乙醇，3 min×2次，梯度酒精脫水（90%、80%、70%），3 min×3次，置于蒸餾水內，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗，5 min×3次，TMA上滴加3%H2O2，室溫靜置10 min，PBS沖洗，5 min × 3次，抗原修復，PBS沖洗5 min×3次，滴入山羊血清封閉液，靜置20 min，去除多余液體，滴入一抗50 μL，室溫靜置60 min，滴加二抗50 μL，室溫靜置60 min，PBS沖洗3次，每次5 min，拭干切片周圍液體，滴入顯色劑DAB，室溫靜置5～10 min，顯微鏡下觀察，顯色完畢蒸餾水沖洗，終止顯色，蘇木精復染2 min，自來水沖洗，鹽酸酒精分化2 s，自來水沖洗，脫水，透明，中性樹膠封片。每切片均隨機取5個高倍視野，鏡下觀察細胞陽性情況，SRC?1、NCoR、ER、PR細胞陽性判定標準：采用改良法［7］，觀察各切片染色細胞比例及強度，染色細胞比例分5級，分別為0分（染色細胞＜5%）、1分（染色細胞占5%～25%）、2分（染色細胞占25%～30%）、3分（染色細胞占50%～75%）、4分（染色細胞超過75%）；染色強度分為4級，分別為0（不著色）、1（淺黃色）、2（棕黃色）、3分（深棕色），染色細胞計數計分×染色強度計分為最終結果，陽性：≥1分（弱陽性：2～3分；中度陽性：4～5分；強陽性：＞5分）；陰性：＜ 1分。（2）RT?PCR法。留取子宮內膜組織60 mg置入RNase Free dish內，加入預冷Trizol，快速剪碎組織，成分研磨，加入Trizol，混勻，置入RNase Free EP管，靜置，加氯仿，混勻，靜置5 min后離心，吸上層水相液，加入異丙醇混勻，靜置后離心，加入預冷75%乙醇，洗滌RNA，沉淀后離心，棄上清，加預冷無水乙醇，離心，棄上清，提取總RNA，-80℃低溫冰箱保存，逆轉錄，EP管內加入總RNA 2 μL+Oligo（dt）180.5 μL+ 雙蒸水 3.5 μL，65 ℃孵育5 min，水浴2 min，加入5 ×Buffer 2.0 μL+10 mmol/L dNTPmix 1.0 μL+RNasin 0.5 U/μL，混合均勻后離心，置于PCR儀器內42℃反應1 h，95℃孵育10 min，70℃反應15 min，設計引物，SRC?1上游引物：5′GTCATTCCTCCTTGAC?CAACTC 3′，下游：5′ATCCCTGTCCGCAGGTATC?TA 3′；NCOR 上游引物：5′ATACTTGCTGGATGGT?GGACT3′，下游：5′TCCTTGCTCTTTTATTTGACG3′；β?actin 上游：5′CCCATCTATGAGGTTACGC3′，下游：5′TTTAATGTCACGCACGATTTC 3′。PCR反應體系：5 × buffer 10 μL+ddH2O 28.75 μL+TakaRa TX Taq HS 0.25 μL+ 上下游引物各 0.5 μL+cD?NA 10μL，共50 μL，反應條件：94 ℃ 1 min，94 ℃30 s，57 ℃退火30 s，75 ℃ 1 min，25～35個循環，72℃延伸5 min，擴增結束加1.5%瓊脂凝膠，紫外燈觀察，凝膠系統照相，采用Gel?Pro Analyzer凝膠分析軟件記錄各條帶光密度，將SRC?1、NCoR基因擴增產物與內參β?actin條帶積分光密度值比值作為mRNA相對表達水平。

1.4 統計學方法 研究數據均采用SPSS 19.0軟件進行處理，計量資料采用t檢驗或單因素方差分析，計數資料采用χ2檢驗，各指標相關性分析采用Spearman相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮內膜重度不典型增生鏡下特點 子宮內膜重度不典型增生鏡下見增生狀態活躍，見細胞核不同程度異型性，細胞核形狀一致，呈圓形或橢圓形，胞質嗜酸性紅染或減少，見復雜腺體結構（圖1A），間質減少，腺腔內連接，部分見篩孔狀結構或共壁表現（圖1B、C），見密集腺體增生（圖1D），腺上皮指狀突起，形成豐富腔內乳頭結構（圖1E、F）。

2.2 兩組子宮內膜組織SRC?1、NCoR、ER、PR陽性率比較 觀察組SRC?1陽性率（圖2～3）高于對照組（P＜0.05），其NCoR（圖4～5）、ER、PR表達陽性率低于對照組，對比差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

圖1～6 子宮內膜重度不典型增生腺體異常結構圖，HE×200Fig.1～6 abnormal structural map of endometrium severe atypical hyperplasia，HE x 200

表1 兩組子宮內膜組織SRC?1、NCoR、ER、PR陽性率比較Tab.1 Comparison of the positive rates of SRC?1，NCoR，ER and PR in the endometrium of the two groups 例（%）

2.3 兩組子宮內膜組織SRC?1、NCoR mRNA表達水平比較 觀察組子宮內膜組織SRC?1 mRNA水平明顯高于對照組，其NCoR mRNA水平低于對照組，對比差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

2.4 子宮內膜重度不典型增生內膜組織SRC?1、NCoR表達與ER、PR相關性分析 子宮內膜重度不典型增生患者內膜組織SRC?1與ER表達呈負相關，而NCoR與PR表達水平呈正相關（P＜0.05），見表3。

圖7 子宮內膜重度不典型增生SRC?1表達（SP×200）Fig.7 SRC?1 expression（SP × 200）of endometrial severe atypical hyperplasia

圖8 正常子宮內膜src?1表達（sp×200）Fig.8 SRC?1 expression in normal endometrium（SP × 200）

圖9 子宮內膜重度不典型增生NCoR?1表達（SP×200）Fig.9 NCoR?1 expression（SP × 200）of endometrial severe atypical hyperplasia

圖10 正常子宮內膜NCoR?1表達（SP×200）Fig.10 NCoR?1 expression in normal endometrium（SP×200）

表2 兩組子宮內膜組織SRC?1、NCoR mRNA表達水平比較Tab.2 Comparison of the expression level of SRC?1 and NCoR mRNA in the endometrium tissue of two groups ±s

表2 兩組子宮內膜組織SRC?1、NCoR mRNA表達水平比較Tab.2 Comparison of the expression level of SRC?1 and NCoR mRNA in the endometrium tissue of two groups ±s

組別觀察組對照組t值P值SRC?1 mRNA 33.45±16.52 7.25±3.54 8.565＜0.001 NCoR mRNA 6.54±4.26 34.84±5.45 27.010＜0.001

表3 子宮內膜重度不典型增生內膜組織SRC?1、NCoR表達與ER、PR相關性分析Tab.3 Correlation Analysis of SRC?1,NCoR expression and ER and PR in endometrial severe atypical endometrium

3 討論

子宮內膜癌系女性生殖系統常見惡性腫瘤，子宮內膜重度不典型增生則為癌前病變的主要表現形式，目前認為子宮內膜不典型增生進展為子宮內膜癌主要與雌激素持續刺激子宮內膜壁有關［8］。BARISH 等［9］發現，無排卵、無孕激素對抗雌激素替代療法、內分泌功能性腫瘤等均與子宮內膜不典型增生存在密切關聯。子宮內膜癌作為激素依賴性腫瘤，其對雌激素有其較高的應答型，而雌激素及孕激素通過與子宮內膜ER、PR受體特異性結合后將信號傳導其細胞特定部位，并影響相關基因調控及子宮內膜上皮細胞代謝。本研究發現，子宮內膜重度不典型增生患者其內膜組織ER、PR陽性率較正常子宮內膜組織低，提示子宮內膜重度不典型增生患者其內膜組織雌孕激素受體水平存在一定程度的改變，主要與子宮內膜組織ER、PR表達異常可能引起局部雌激素代謝紊亂，影響雌激素作用，導致子宮內膜不典型增生有關。但雌激素活性受到多個受體亞型調節，因此無法單純通過ER水平的變化來判斷子宮內膜不典型增生表現［10］。近年來發現，類固醇受體輔活化子家族可調節ER、PR活性，影響細胞增殖［11］。

SRC系類固醇受體輔活化子家族成員，其分子C端受體作用區同存在不同LXXLL系列，其以配體依賴形式與核受體相互作用，并通過甲基化、乙酰基化等輔助因子提高核受體基因轉錄活性，對ER、PR、糖皮質激素受體、甲狀腺素受體等發揮轉錄調節效應，影響生長、發育其增殖［12］。其中SRC?1則為SRC家族中最早被克隆的基因類型，在正常組織中可見表達，同時在部分腫瘤患者中可見SRC?1異常表達。王麗紅等［13］發現，乳腺癌患者機體SRC?1存在明顯過度表達現象，對雌激素所誘導細胞增殖有明顯的強化效應。SRC?1具有組氨酸乙酰化轉移酶的活性，能夠改變轉錄因子與靶基因的結合力，影響基因的轉錄。REINERI等［14］等報道稱在乳腺癌細胞中ER/SRC?1復合物的存在增強了雌激素誘導的細胞增殖能力。所以類固醇受體輔助活化因子在調節ER功能上發揮了重要作用。NCoR為核受體輔阻遏子超家族成員，是非配體化核受體主要結合蛋白，與SRC相反，其具備去乙酰化轉移酶活性，可與核受體結合蛋白作用發揮疏水裂隙作用，抑制其轉錄活性。且NCoR其雌激素受體作用位點與SRC?1相同，因此形成輔活化子?輔阻遏子開關，兩者共同競爭與該位點結合，共同調節雌激素轉錄活性。NCoR分子的C端含有RID受體作，丁巍等［15］發現，NCoR在孕酮存在的情況下可以與PR形成復合物，招募PR反應元件，從而抑制黃體酮靶基因的轉錄。且該研究表示，乳腺癌患者NCoR表達水平上調可抑制ER所誘導癌細胞增殖。本研究發現，子宮內膜重度異常增生患者其子宮內膜組織SRC?1表達水平低于對照組，且其NCoR表達水平高于對照組，提示子宮內膜重度不典型增生患者其子宮內膜組織存在高水平表達，而低水平ER與SRC?1結合可能強化核受體活性，提高子宮內膜對雌激素的敏感性，促進子宮內膜異常增生。同時其NCoR表達水平較低，主要可能與子宮內膜重度不典型增生患者其內膜組織PR水平較低有關，可進一步下調NCoR水平，強化核受體活性，促進子宮內膜增生。

此外，本研究還發現，SRC?1與ER表達呈負相關，而NCoR與PR表達呈正相關，主要可能與低水平ER可激活SCR?1表達，而低水平PR可誘導NCoR表達水平降低有關，且高水平SRC?1與低水平NCoR均可介導雌激素調節，影響子宮內膜細胞生長及增殖，促進子宮內膜細胞呈浸潤性生長，增加癌變風險，本研究創新點為探討SRC?1和NCoR在子宮內膜重度不典型增生患者中的表達情況，為子宮內膜重度不典型增生的預后提供一個新的參考指標，并為子宮內膜重度不典型增生激素治療提供更為有力的輔助判斷指標。