重復經顱直流電刺激對帕金森病模型大鼠抑郁行為的改善作用及其機制

王春雷，常永麗，韓玲娜

(1.長治醫學院生物醫學工程系，山西 長治 046000； 2.長治醫學院生理學教研室，山西 長治 046000)

經顱直流電刺激(transcranial direct current stimulation,tDCS)是一種非侵入性的、無創的腦刺激技術，利用微弱的直流電調節大腦皮層神經元電活動，從而影響大腦皮層的功能[1]。研究[2]顯示：tDCS可明顯改善抑郁癥患者的抑郁行為。單次tDCS的作用持續時間短，使用重復tDCS可以延長作用持續時間[3-4]，在臨床應用更為廣泛。帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的臨床表現以運動系統癥狀為主，同時伴有一系列精神障礙，抑郁是PD患者最常見的一種精神障礙[5]。已有研究[6-7]證明：重復tDCS對PD大鼠和患者的運動系統癥狀有明顯的改善作用，但重復tDCS對PD相關抑郁行為是否具有改善作用以及其作用機制尚不清楚。本實驗采用重復陽極或陰極tDCS刺激PD大鼠額葉區，通過觀察PD大鼠抑郁行為的變化以及抑郁相關腦區單胺類遞質水平的變化，探討重復tDCS對PD相關抑郁行為的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 32只健康雄性SD大鼠，體質量230～280 g，由西安交通大學實驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK(陜)2012-003。6-羥多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)、地昔帕明、阿撲嗎啡(apomorphine,APO)購自美國Sigma公司。腦立體定位儀購自深圳瑞沃德公司，經顱直流電刺激儀由西安交通大學生物醫學工程研究所提供。

1.2 實驗分組 大鼠在標準環境下適應性飼養1周后進行實驗。32只大鼠隨機分為假手術組、PD組、陽極重復tDCS組和陰極重復tDCS組，每組8只。

1.3 PD模型的制備 除假手術組外，其余各組大鼠采用右側內側前腦束(medial forebrain bundle,MFB)局部注射6-OHDA制備單側完全損毀的PD大鼠模型。大鼠經腹腔注射4%水合氯醛(400 mg·kg-1)麻醉后，固定于腦立體定位儀上。于術前30 min腹腔注射地昔帕明(25 mg·kg-1)以保護去甲腎上腺素(noradrenaline,NA)能神經元。頭部正中切開，暴露顱骨，根據大鼠腦立體定位圖譜確定右側MFB坐標(AP：- 4.4 mm；L：1.2 mm；D：7.8～7.9 mm)，于MFB坐標上方顱骨處鉆直徑 2 mm小孔，剝離硬腦膜，暴露腦表面。將尖端粘有玻璃微電極的10 μL微量進樣器推進至MFB位置，并以緩慢速度將4 μL含12 μg 6-OHDA的溶液注射至右側MFB。假手術組大鼠MFB位置局部注射等量的生理鹽水。

APO誘導旋轉行為實驗用于模型檢測，于造模術后1周進行。大鼠頸部皮下注射APO(0.05 mg·kg-1)，觀察15 min內大鼠的行為，如果出現恒定向健側(左側)旋轉，且大于25圈/ 5 min，則視為模型制備成功，其余均予以淘汰。本實驗所用PD大鼠注射APO后，5 min內旋轉均大于32圈。

1.4 tDCS 于造模術后2周進行刺激電極固定。刺激電極采用直徑為2 mm的圓柱形塑料管，管內填充導線和海綿，用牙科水泥將刺激電極固定于大鼠右側額葉區，參考電極固定于胸腹部。刺激時用生理鹽水將海綿浸濕保證電極的導電性[8]。為了保證不燒傷大鼠腦組織，采用80 μA直流電流作為刺激電流[9]。電極固定24 h后進行直流電刺激實驗。其中假手術組和PD組大鼠不給予電刺激。陽極重復tDCS組大鼠給予電流強度為80 μA陽極電流刺激，陰極重復tDCS組大鼠則給予相同強度的陰極電流刺激。各重復tDCS組大鼠給予重復tDCS，強度不變，每天刺激時間為30 min，連續刺激10 d。

1.5 行為學實驗 tDCS結束后進行強迫游泳實驗和蔗糖偏好實驗檢測大鼠的抑郁行為。①強迫游泳實驗：第1天進行適應性訓練，將大鼠放入水中游泳15 min，24 h后進行檢測，記錄將大鼠放入水中 5 min內的不動時間。不動時間定義為大鼠靜止漂浮于水面而不做任何動作，或為了保持頭部露出水面而僅作的微小活動保持的時間。不動時間可作為抑郁行為的檢測指標[10]。②蔗糖偏好實驗：將大鼠單籠飼養，雙瓶飲1%蔗糖溶液24 h，適應后禁食禁水24 h，再同時給予水和1%蔗糖溶液各1瓶，自由飲水1 h，期間隨意交替2瓶位置數次。1 h 內蔗糖消耗量可反映大鼠的抑郁行為表現，減少的蔗糖消耗量可作為抑郁行為的檢測指標[11]。蔗糖消耗量=[糖水消耗量/(糖水消耗量+水消耗量)]×100%。

1.6 神經化學檢測 行為學實驗后，采用高效液相色譜-電化學法檢測各組大鼠腦內抑郁相關腦區內側前額葉皮質(medial prefrontal cortex,mPFC)和中縫核(raphe nuclei,RN)中單胺類遞質多巴胺(dopamine,DA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)和NA水平。具體方法：大鼠斷頭取腦，迅速分離出mPFC和RN，稱質量，按照每4 mg組織加入1 mL高氯酸(0.3 mol·L-1)的比例加入高氯酸，采用超聲粉碎儀將組織勻漿，4 ℃低溫離心后去上清液，按1∶2比例將上清液與流動相混合，吸取20 μL混勻的樣本加入自動進樣器中，單胺類遞質通過分析柱被分離后，經電化學檢測器定量分析，計算組織中各種單胺類遞質水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠抑郁行為 與假手術組比較，PD組大鼠的不動時間明顯延長(t=4.437,P<0.01)，蔗糖消耗量明顯減少(t=3.354,P<0.05)，提示PD模型大鼠有抑郁行為表現。與PD組大鼠比較，重復tDCS組大鼠的不動時間明顯降低，其中陽極重復tDCS組(t= 4.572,P<0.01)較陰極重復tDCS組(t=3.585,P<0.05)降低更明顯；與PD組比較，陽極重復tDCS組大鼠的蔗糖消耗量明顯增加(t=3.095,P<0.05)，而陰極重復tDCS組大鼠的蔗糖消耗量雖然有增加趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不動時間和蔗糖消耗量

GroupImmobility time(t/s) Sucrose consumption(η/%)Sham operation41.38±3.52 76.18±6.29PD 78.63±9.33??55.10±3.96?Anodal repeated tDCS42.75±4.04△△ 74.55±4.01△Cathodal repeated tDCS51.75±5.35△ 64.23±2.76

*P<0.05，**P<0.01 compared with sham operation group;△P<0.05，△△P<0.01 compared with PD group.

2.2 各組大鼠mPFC和RN中單胺類遞質水平 在mPFC中，與假手術組比較，PD組大鼠DA和5-HT水平明顯降低(DA：t=3.203,P<0.05；5-HT：t=4.492,P<0.01)，但NA水平無明顯變化(P>0.05)；與PD組比較，陽極重復tDCS組大鼠DA和5-HT水平均明顯升高(DA：t= 2.961,P<0.05; 5-HT：t=3.142,P<0.01)，陰極重復tDCS組大鼠僅5-HT水平明顯升高(t=2.843,P<0.05)，陽極重復tDCS組和陰極重復tDCS組大鼠mPFC中NA水平均無明顯變化(P>0.05)。在RN中，與假手術組比較，PD組大鼠5-HT水平明顯降低(t=3.318,P<0.01)，DA和NA水平雖有下降趨勢，但差異均無統計學意義(P>0.05)；與PD組比較，陽極重復tDCS組大鼠DA和5-HT水平均明顯升高(DA:t=3.881,P<0.01; 5-HT:t=3.870,P<0.01)，NA水平無明顯變化(P>0.05)；陰極重復tDCS組大鼠DA和NA水平無明顯變化(P>0.05)，mPFC中5-HT水平明顯升高(P<0.05)。見表2。

3 討 論

PD是一種神經系統退行性疾病，臨床上以運動系統癥狀為主，同時伴發有一系列非運動系統癥狀[12]。抑郁是PD最常見的非運動系統癥狀，其在PD患者中發生率達到40%～ 50%，嚴重影響患者的生活質量[13]。本研究中，與假手術組比較，采用單側MFB注射6-OHDA制備的PD模型大鼠出現不動時間的明顯延長和蔗糖消耗量的明顯降低，提示黑質致密部單側完全損毀可以誘發大鼠出現抑郁行為，與以往的研究[14]結果一致。目前，對PD抑郁的治療方法主要包括心理療法、藥物治療和行為學治療等，治療效果不佳，甚至會出現嚴重的副作用。

表2 各組大鼠mPFC和RN中DA、5-HT和NA水平

Tab.2 Levels of DA,5-HT and NA in mPFC and RN of rats in various groups

GroupDAmPFCRN5-HTmPFCRNNAmPFCRNSham operation300.02±52.59286.22±35.41679.17±177.911488.22±101.44675.46±53.35416.26±49.39PD 142.98±20.51?224.38±28.92372.86±38.58??883.66±145.29??517.79±46.32334.21±25.09Anodal repeated tDCS288.16±32.12△424.08±45.74△△587.13±48.46△△1588.88±148.53△△590.14±29.31454.31±67.08Cathodal repeated tDCS200.38±24.28295.01±33.35566.69±109.74△1330.44±113.39547.06±30.68361.31±20.12

*P<0.05，**P<0.01 compared with sham operation group;△P<0.05，△△P<0.01 compared with PD group.

tDCS是一種非侵入性的腦刺激技術，已有研究[2，15-16]表明tDCS對抑郁行為有明顯的改善作用，加之tDCS不良反應少、使用方便，在臨床上已經成為治療抑郁的一種新方法。tDCS對于PD相關抑郁行為是否有治療作用，目前尚無相關報道。本研究擬通過對PD模型大鼠使用重復tDCS，觀察大鼠的抑郁行為及相關腦區單胺類遞質水平的變化，揭示tDCS對PD相關抑郁行為的作用及其相關機制，為臨床尋找新方法治療PD相關抑郁行為提供理論依據。

tDCS分為陽極tDCS和陰極tDCS，電極的陽極靠近神經元胞體或樹突時，膜電位降低，發生去極化，神經元興奮性增強；相反，陰極靠近時膜電位升高，發生超極化，神經元興奮性降低[17]。本研究結果顯示：陽極重復tDCS和陰極重復tDCS對PD相關抑郁行為均有一定作用。在強迫游泳實驗中，陽極重復tDCS組和陰極重復tDCS組PD大鼠的不動時間均明顯縮短；在蔗糖偏好實驗中，陽極重復tDCS組PD大鼠的蔗糖消耗量明顯增加，陰極重復tDCS組大鼠雖然有增加趨勢，但差異無統計學意義。在反映抑郁行為的2種實驗中大鼠出現以上差異，可能是因為重復tDCS對PD大鼠的運動行為會有一定的改善作用[5]，而大鼠在強迫游泳實驗中的不動時間長短一定程度上也與其運動能力有關，而蔗糖偏好實驗恰好能夠排除tDCS對大鼠運動能力的影響 。本研究提示：重復tDCS對PD相關抑郁行為具有改善作用，其中陽極重復tDCS的作用強于陰極重復tDCS。

研究[18]表明：tDCS具有抗抑郁作用，其機制可能是tDCS通過提高神經元可塑性以緩解抑郁癥狀。目前臨床使用的抗抑郁藥可提高中樞神經系統中單胺類遞質水平[19-20]，說明單胺系統在抑郁行為中發揮重要作用。tDCS的抗抑郁作用與腦內單胺類遞質水平變化是否有關，目前尚無相關報道。本研究采用高效液相-電化學法觀察假手術組、PD組、陽極重復tDCS組和陰極重復tDCS組大鼠腦內mPFC和RN中DA、5-HT及NA水平的變化，結果顯示：與假手術組比較，PD組大鼠mPFC中DA及5-HT水平明顯降低，RN中5-HT水平明顯降低，提示PD大鼠出現抑郁行為與腦內DA及5-HT水平降低有關；與PD組比較，陽極重復tDCS組大鼠mPFC和RN中DA和5-HT水平明顯升高，陰極重復tDCS組只有mPFC中5-HT水平明顯升高，RN中5-HT以及mPFC和RN中DA水平有升高趨勢，但差異無統計學意義，而陽極和陰極重復tDCS對NA水平均無明顯影響。因此，重復tDCS可以升高大鼠腦內單胺類遞質水平，尤其是DA和5-HT水平，這可能是tDCS發揮抗抑郁效應的機制之一。

本研究結果證實：通過對額葉區使用重復tDCS可改善大鼠PD相關抑郁行為，該作用可能與改變相關腦區中單胺類遞質水平有關。陽極重復tDCS對大鼠抑郁行為的改善作用強于陰極重復tDCS，其具體機制尚不明確，需要后續進一步研究。