lncRNA ROR和lncRNA ATB在膀胱癌患者中的表達情況及其臨床意義

張立冬，李 輝，李 娟

(1.重慶市開州區人民醫院泌尿外科 405400；重慶市開州區婦幼保健院：2.醫務科；3.超聲科 405400)

膀胱癌為泌尿系統最常見的惡性腫瘤，在歐美國家發病率居男性惡性腫瘤的第4位，而且近年來有發病率增加和年輕化的趨勢[1]。較為明確的兩大致病危險因素是吸煙和長期接觸工業化學產品，均與患者基因層面的改變有關，其表觀和遺傳改變都參與了腫瘤的發生、發展[2]。全基因組表達芯片分析和實時熒光定量PCR(RT-PCR)測定都提示一系列的信號通路在膀胱癌中存在異常的激活，這些通路與細胞分化、增殖、侵襲、轉移，以及血管生成有關，而這些通路在不同的膀胱中也存在著異質性[3]。膀胱癌的發生和發展是一個多因素、多步驟的慢性化的過程[4]。深入了解膀胱癌的發生機制，將為膀胱癌的預防和治療提供新的思路。長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)是腫瘤研究領域的一個新的成員，現在研究表明其在腫瘤的發生和腫瘤的抑制通路中有潛在的重要作用。研究顯示lncRNA ROR(以下簡稱ROR)和lncRNA ATB(以下簡稱ATB)在膀胱癌的發生發展中均具有重要作用[5-6]。因此，本文為進一步探討ROR和ATB在膀胱癌患者中的表達情況和臨床意義，采用RT-PCR檢測膀胱癌患者癌組織和癌旁組織、膀胱癌患者血清和健康人血清中ROR和ATB表達水平，分析ROR和ATB表達與患者臨床病理特征的關系、兩者表達的相關性以及其表達對患者預后的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取在重慶市開州區人民醫院泌尿外科住院的60例膀胱癌患者和同期60例健康者為研究對象，取腫瘤組織和癌旁組織(距離腫瘤邊緣至少5 cm的正常膀胱組織)，分別抽取患者術前膀胱癌患者血清和健康者血清。60例膀胱癌患者年齡36～77歲，平均(58.2±7.5)歲；男45例，女15例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期37例，Ⅲ～Ⅳ期23例，淋巴結轉移19例。健康者年齡35～75歲，平均(57.8±8.1)歲；男42例，女18例。兩組研究對象年齡、性別構成等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法 根據美國國立生物技術信息中心(NCBI)數據庫中ROR和ATB的基因序列，通過Primer Express 2.0設計擴增產物，引物均由大連寶生物工程公司合成。取患者相應組織標本用肝素抗凝后，分離并計數(5～10)×106細胞與Trizol總RNA提取液1 mL混勻，凍存于-20 ℃環境中。采用Trizol法進一步提取細胞的總RNA。產物用20 μL的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解。RNA完整度檢測用電泳法，RNA水平和純度的計算則用紫外分光光度計測量。提取1 μL的總RNA來構成10 μL反應體系，并參照逆轉錄試劑盒說明書以進行cDNA合成。將cDNA用于進一步常規PCR擴增。條件：94 ℃預變性1 min，94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；71 ℃，40 s；共30個循環，最后72 ℃延伸5 min。以U6為內參照。

1.3觀察指標 檢測膀胱癌患者癌組織、癌旁組織、血清和健康者血清中ROR和ATB表達情況；分析ROR和ATB在膀胱癌患者中組織與血清中表達的相關性，進一步分析膀胱癌患者臨床病理特征年齡、腫瘤大小、病理分級、淋巴結轉移、遠處轉移和臨床分期與其癌組織和血清中ROR和ATB表達水平的關系；分析ROR和ATB兩者表達的相關性以及其表達對患者預后的影響。

2 結 果

2.1ROR和ATB在膀胱癌組織和血清中的表達 ROR在膀胱癌組織中的相對表達量(1.42±0.15)明顯高于癌旁組織(0.68±0.08)，差異有統計學意義(P<0.05)；ATB在膀胱癌組織中的相對表達量(1.52±0.16)明顯高于癌旁組織(0.81±0.09)，差異有統計學意義(P<0.05)；ROR在膀胱癌患者血清中的相對表達量(1.09±0.10)明顯高于健康人血清(0.63±0.05)，差異有統計學意義(P<0.05)；ATB在膀胱癌患者血清中的相對表達量(1.32±0.12)明顯高于健康人血清(0.71±0.07)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2ROR和ATB在膀胱癌患者中組織與血清中表達的相關性 膀胱癌患者組織中ROR和ATB的表達與血清中的ROR和ATB的表達間呈正相關(r=0.472、0.299，P<0.05)。

2.3ROR在膀胱癌患者中的表達與其臨床特征的關系 結果顯示，ROR在膀胱癌患者組織和血清表達水平與患者腫瘤大小、病理分級、淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期有關(P<0.05)，與患者年齡和性別無關(P>0.05)。見表1。

2.4ATB在膀胱癌患者中的表達與其臨床特征的關系 結果顯示，ATB在膀胱癌患者組織和血清表達水平與患者腫瘤大小、病理分級、淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期有關(P<0.05)，與患者年齡和性別無關(P>0.05)。見表2。

2.5膀胱癌淋巴結轉移與臨床病理特征的關系 在膀胱癌患者中，淋巴結轉移與年齡和性別無關(P>0.05)；與腫瘤大小、病理分級、遠處轉移、TNM分期、ROR高表達和ATB高表達有關(P<0.05)。見表3。

2.6膀胱癌ROR和ATB在膀胱癌組織中的表達與生存預后的關系 Kaplan-Meier分析顯示，ROR和ATB高表達3年生存率(68.33%和58.33%)明顯低于ROR和ATB低表達組(86.67%和88.33%)，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 ROR在膀胱癌患者中的表達與其臨床特征的關系

表2 ATB在膀胱癌患者中的表達與其臨床特征的關系

表3 膀胱癌淋巴結轉移與臨床病理特征的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

現代生物學研究表明人類基因組編碼蛋白的基因大約只有20 000個，僅占人類基因組序列的2%，但是通過芯片技術，以及全基因組和轉錄組的測序表明，基因組中至少90%是被轉錄的[7]。有研究發現，人類轉錄組遠比蛋白編碼基因以及它們的剪切變體復雜，而顯示出有大量的反義、重疊的非編碼RNA的表達。盡管起初懷疑這些表達是轉錄組的噪聲，而最新的證據表明這些基因組中的黑箱可能在細胞中的發育和代謝中發揮重要的作用[8-9]。lncRNA現在已經顯示其具有一系列的生物學功能，其中的一些功能包括基因組的印記、轉錄組的調控，這些功能的破壞或失調在腫瘤的發生中起了關鍵的作用。

lncRNA具有能夠識別互補序列，而這一特定的作用，在RNA的轉錄后加工過程中有重要的意義，這些轉錄后加工的過程包括剪切、編輯、轉運、翻譯以及降解[10-11]。哺乳動物大多數的基因都表達其反義轉錄物，而這些轉錄物構成的一類lncRNA在調控RNA的動力學方面具有較大的優勢。新近研究發現，在膀胱癌中lncRNA-HULC可以作為一種分子誘餌，或者可以稱為miRNA sponge,而其能夠調控隱退miR-372的表達，而影響了其靶蛋白RPKACB的表達[12]。膀胱癌中的另一研究表明，轉化生長因子-β可以促進肝細胞中ATB的表達，而實驗證實ATB可以發揮microRNA sponge的功能，能夠特異性的結合miR-200家族，從而抑制了miR-200作為抑癌microRNA的功能，顯著提高了miR-200靶基因CDK9/2的表達而促進了膀胱癌的轉移[13]。在三陰性乳腺癌中研究發現，ROR也可以特異性的靶向抑制miR-145，而提高了miR-145負向調控的靶基因ARF6的表達，而最終促進了三陰性乳腺癌中細胞的侵襲[14]。目前，關于ROR和ATB在膀胱癌發生、發展作用的研究較少。

在本研究中，采用RT-PCR對膀胱癌患者癌組織和癌旁組織、膀胱癌患者血清和健康者血清中ROR和ATB表達水平進行檢測，發現ROR和ATB在膀胱癌患者癌組織和血清中呈高表達，均明顯高于癌旁組織和健康者血清中的表達(P<0.05)，也有研究顯示ROR和ATB在肺癌、膀胱癌、甲狀腺瘤、多發性骨髓瘤、膀胱癌、胃癌等多種腫瘤中呈異常表達[15-16]。采用Pearson相關性分析顯示膀胱癌患者組織中ROR和ATB的表達與血清中的ROR和ATB的表達間均呈明顯的正相關(P<0.05)，這進一步說明ROR和ATB在膀胱癌中呈高表達，也為ROR和ATB在膀胱癌患者血液檢測成為可能。進一步分析ROR和ATB表達水平與膀胱癌患者臨床預后等相關因素間的關系，結果顯示，ROR和ATB在膀胱癌患者組織和血清表達水平與患者腫瘤大小、病理分級、淋巴結轉移、遠處轉移和臨床分期有關(P<0.05)，與患者年齡和性別無關(P>0.05)。多因素Logistic回歸分析顯示，腫瘤大小、病理分級、遠處轉移、TNM分期、ROR高表達和ATB高表達是膀胱癌淋巴結轉移的獨立危險因素。這進一步表明高表達ROR和ATB的膀胱癌侵襲性強和病情易進展。

分析ROR和ATB和膀胱癌患者的預后關系中，研究結果顯示ROR和ATB高表達3年生存率明顯低于ROR和ATB低表達組。這提示ROR和ATB也是影響膀胱癌患者預后的重要分子。然而，關于ROR和ATB在膀胱癌發生和發展中的作用機制還了解甚少，其在膀胱癌中的作用機制還有待進一步研究[17]。

在本研究中ROR和ATB在膀胱癌患者組織和血清中呈高表達，可能和ROR和ATB隨著腫瘤的進展而擴增有關，同時ROR和ATB在膀胱癌患者組織和血清表達水平與患者腫瘤大小、病理分級、淋巴結轉移、遠處轉移和臨床分期有關。由此可以推斷ROR和ATB在膀胱癌中與患者臨床預后密切相關，同時預后分析也顯示，高表達的ROR和ATB患者3年生存率降低，這是其可能成為膀胱癌預后不良的重要分子標記物，為進一步指導膀胱癌的治療和預后等提供了理論依據。