miR?17?5p在膠質瘤細胞中的作用機制

李城 李昌熙 王大新 戴燕 金世光

江蘇省蘇北人民醫院1疼痛科，2醫學實驗研究中心（江蘇揚州225001）

神經膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤，有術后致殘率高、復發率高、易出現侵襲轉移、難以與周圍組織分清界限、進展迅速、癲癇發生率高等特點，對多種治療方案具有高耐受性［1-3］。惡性腫瘤患者中有15%～25%會發生腦轉移，其中未治療患者生存期僅為1個月左右［4-5］。miR?17?5p在肝癌、宮頸癌、結腸癌、胰腺癌、胃癌、肺癌等中的功能已經文獻報道［6-10］，miR?17?5p在肝癌中通過激活MAPK信號通路促進其增殖和遷移［6］，在宮頸癌中通過靶向TP53INP1抑制細胞增殖和促進細胞凋亡［7］，而其在膠質瘤中的作用尚不清楚。因此，本課題就miR?17?5p對膠質瘤的增殖遷移的作用機制，以及其是否通過參與P13K?AKT信號通路調節膠質瘤細胞對放療的敏感性進行研究。以期為今后惡性膠質瘤放射治療聯合基因治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑 0.25%胰蛋白酶消化液，RNA酶，10%胎牛血清H?DMEM培養液，膠質瘤細胞系U87?2M1、SW1088，pSilencer2.1?U6 neo試劑盒（Ambion，美國）。

1.2 儀器 qRT?PCR儀（ABI StepOne Plus），流式細胞儀（MoFlo XDP），生物安全柜 1205A（FORMA），CO2培養箱（FORMA），倒置顯微鏡 IX70（OLYM?PUS）。

1.3 實驗方法

1.3.1 miRNA芯片技術進行檢測miR?17?5p在膠質瘤中表達 針對3對同一患者來源的膠質瘤組織及其鄰近的癌旁正常組織中的miRNA表達水平，用miRNA芯片技術進行檢測。

1.3.2 qRT?PCR檢測miR?17?5p在膠質瘤細胞中的表達 提取6株膠質瘤細胞系（U87?2M1、SW1088、U87、T98G、U251、U138）和1株正常星狀細胞（NHA）的總RNA，然后反轉加尾，利用qRT?PCR檢測膠質瘤細胞系（U87?2M1、SW1088、U87、T98G、U251、U138）和正常星狀細胞（NHA）中miR?17?5p的表達水平。

1.3.3 qRT?PCR檢測過表達miR?17?5p后膠質瘤細胞中miR?17?5p的表達 向膠質瘤細胞系U87?2M1中轉染miR?17?5p mimics 36～ 48 h后，利用qRT?PCR檢測miR?17?5p的表達水平。

1.3.4 克隆形成實驗檢測膠質瘤細胞克隆形成能力 向膠質瘤細胞系SW1088中分別轉染mimics Control，miR?17?5p mimics，ASO?NC，miR?17?5p?ASO（miRNA拮抗劑），36～48 h后進行平板克隆形成實驗，第14天結束，計數6孔板中形成克隆的數目，觀察miR?17?5p對膠質瘤細胞克隆形成能力的影響。

1.3.5 Transwell檢測miR?17?5p影像膠質瘤細胞的遷移能力 在膠質瘤細胞U87?2M1和SW1088中分別轉染 miR?17?5p mimics或miR?17?5p ASO，36 h后進行transwell實驗，計數通過膜的細胞數平均值。

1.3.6 流式凋亡檢測miR?17?5p影像膠質瘤細胞對放療的敏感性 將膠質瘤細胞SW1088分為6組，3組轉染mimics Control，3組轉染miR?17?5p mimics，轉染24 h后，分別將一組mimics control和一組miR?17?5p mimics用0、4、6 Gy的X線照射（源皮距為100 cm，劑量率為320 cGy/min，瓦里安600 C，加速器6 MV X線照射），每組的每個劑量點均重復3次，然后用Annexin V?PI雙染色法驗證miR?17?5p對膠質瘤細胞的放療增敏性的調節。

1.4 統計學方法 應用SPSS12.0統計分析軟件，統計學處理采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因芯片結果顯示miR?17?5p在膠質瘤中高表達 芯片結果顯示與相應的癌旁正常組織相比，miR?17?5p在3個膠質瘤組織樣本中表達水平相對比較高（P＜0.05），芯片結果見圖1。

圖1 基因芯片檢測膠質瘤組織中miRNA的表達變化Fig.1 The miRNA expression differences observed in glioma cancer cells obtained by gene chip detection analysis

2.2 qRT?PCR檢測miR?17?5p在膠質瘤細胞中的表達 檢測結果表明，與正常星狀細胞（NHA）相比，miR?17?5p在膠質瘤細胞系（U87?2M1、SW1088、U87、T98G）中高表達，其中膠質瘤細胞系U87?2M1、SW1088表達量比較高，這與基因芯片結果一致，結果見圖2，其中用U6作為內參。接下來細胞實驗采用膠質瘤系U87?2M1、SW1088。

圖2 qRT?PCR檢測膠質瘤細胞系和正常星狀細胞系中miR?17?5p的表達水平Fig.2 The expression level of miR?17?5p in glioma cancer cells and normal astrocytes analyzed by qRT?PCR

2.3 qRT?PCR檢測過表達miR?17?5p后，在膠質瘤細胞中miR?17?5p的表達 檢測結果表明，在膠質瘤細胞（U87?2M1）中過表達miR?17?5p后，miR?17?5p的表達水平升高，結果見圖3。

圖3 qRT?PCR檢測膠質瘤細胞中miR?17?5p的表達水平（U6作內參）Fig.3 The expression level of miR?17?5p in glioma cancer cells assessed by qRT?PCR（U6 as control）

2.4 克隆形成實驗表明miR?17?5p促進膠質瘤細胞的增殖 實驗結果發現過表達miR?17?5p增加膠質瘤細胞SW1088的克隆形成能力，而轉染miR?17?5p?ASO將會降低膠質瘤細胞SW1088的克隆形成能力。結果如圖4所示，轉染后48 h檢測的不同表達水平的miR?17?5p對SW1088細胞集落形成能力的影響（P＜0.05）。

圖4 miR?17?5p對膠質瘤細胞SW1088集落形成能力的影響Fig.4 The effect of miR?17?5p on the colony formation of glioma cancer cells SW1088

2.5 Transwell表明miR?17?5p促進膠質瘤細胞的侵襲 轉染miR?17?5p mimics后，細胞侵襲能力與對照組相比升高；轉染miR?17?5p ASO后，細胞侵襲能力與對照組相比降低，結果見圖5。可見miR?17?5p可以促進膠質瘤細胞U87?2M1和SW1088的侵襲能力。

2.6 流式凋亡檢測表明miR?17?5p可以降低膠質瘤細胞對放療的敏感性 分析流式細胞檢測結果發現轉染mimics control組隨著X線照射劑量的增加（0、4、6 Gy），膠質瘤細胞系SW1088的細胞凋亡數目百分比依次增加，0 Gy的X射線照射時凋亡細胞百分數是1.38%，4 Gy的X射線照射時凋亡細胞百分數是14.25%，6 Gy的X射線照射時凋亡細胞百分數是32.92%。而轉染miR?17?5p mimics組隨著X線照射劑量的增加（0、4、6 Gy），膠質瘤細胞系SW1088的細胞凋亡數目百分比也依次增加，0 Gy的X射線照射時凋亡細胞百分數是0.78%，4 Gy的X射線照射時凋亡細胞百分數是7.43%，6 Gy的X射線照射時凋亡細胞百分數是17.34%。而相同劑量X射線照射時，轉染miR?17?5p組膠質瘤細胞SW1088的凋亡細胞百分比顯著低于轉染mimics control組。這些結果表明miR?17?5p可以降低膠質瘤細胞SW1088對放療的敏感性。

圖5 miR?17?5p對膠質瘤細胞U87?2M1和SW1088侵襲能力的影響Fig.5 The effect of miR?17?5p on the invasion and metastasis of U87?2M1 and Sw1088 glioma cancer cells

圖6 流式檢測miR?17?5p對放射敏感性的檢測Fig.6 The FACS analysis of radio?sensitivity of miR?17?5

3 討論

腦膠質瘤是顱內最常見的呈浸潤性生長的惡性腫瘤，占全部顱內腫瘤的40%～50%［11］，膠質瘤臨床治療的難點主要是由于其臨床表現和癥狀、影像學或形態學預警及其浸潤性沒有顯著的特征［12-13］。目前越來越多的文獻報道，miRNAs參與細胞的增殖、凋亡、細胞分化等多種生物學行為［14］，同時也可參與惡性腫瘤的侵襲、遷移、腫瘤微環境的調節以及腫瘤干細胞的調控等［15-18］。

本實驗利用miRNA芯片技術進行檢測過程中發現miR?17?5p在膠質瘤組織樣本中表達水平相對比較高，筆者預測miR?17?5p與膠質瘤的發生與發展有關。因此，為了進一步驗證設想進行了qRT?PCR檢測膠質瘤細胞系（U87?2M1、SW1088、U87、T98G、U251、U138）和正常星狀細胞（NHA）中miR?17?5p的表達水平。結果表明膠質瘤細胞U87?2M1、SW1088中的miR?17?5p的表達水平明顯增高。qRT?PCR檢測過表達miR?17?5p后，在膠質瘤細胞中miR?17?5p的表達水平升高。通過克隆形成實驗和Transwell實驗可以看出miR?17?5p具有增強膠質瘤細胞的生長和遷移作用，反之降低生長和遷移能力。同時，通過流式細胞儀檢測了miR?17?5p對膠質瘤細胞中放療敏感性的作用，結果顯示miR?17?5p可以降低膠質瘤細胞SW1088對放療的增敏性調節。本實驗探討證實了以下兩個個方面的科學問題：（1）證實miR?17?5p促進膠質瘤細胞增殖和遷移；（2）確立miR?17?5p與膠質瘤對放療敏感性之間的關系。miRNA發揮作用存在一定的復雜性，同一種miRNA可能同時影響多個靶mRNA，而同一種靶mRNA也可能同時被多個miRNA靶定。因此，在分析這些靶基因時，可能會出現單一靶基因在體外分析時作用相對明顯，但是體內實驗效果并不理想等特點。此時可以考慮多個基因聯合作用并詳細分析在體內情況下，是哪些因素起主導作用，同時考慮體內其他miRNA作用的代償作用，從而客觀分析miR?17?5p調節膠質瘤細胞增殖遷移和放療敏感性的具體分子機制。

本實驗研究結果表明miR?17?5p在膠質瘤細胞的發生和發展過程中扮演著重要的角色，同時與膠質瘤細胞的放療敏感性有關。但具體分子機制尚不明確，在下一步工作中需深入探討膠質瘤發生和發展過程中的信號通路，確定miR?17?5p作用的直接靶基因，明確miR?17?5p在信號通路中的作用機制。