環狀RNA circ0023033及其靶基因在肺癌中的表達及診斷標志物意義

曹金秀 江雁瓊 孫嘉

廣州醫科大學附屬第五醫院（廣州510700）

肺癌在最近幾十年里逐漸成為全世界發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，伴隨醫學技術的不斷發展，肺癌診斷和治療已取得了很大的進步，但是患者的5年生存率仍然很低。大量的研究表明［1］，肺癌發病是一個多基因參與、多步驟的復雜病變過程，先是產生組織學上可以辨認的癌前病變，最后導致侵襲性腫瘤產生。肺癌的危險因素包括接觸到的環境或職業致癌物，如汽車尾氣、芳香化合物、石棉、砷、吸入的放射性物質等。盡管越來越多的肺癌危險因素已經被明確，但是其發生發展的機制仍不清楚。隨著非編碼RNA研究的不斷深入，人們發現其在肺癌的發生發展過程中具有十分重要的作用。環狀RNA（circular RNA，cir?cRNA）是一類新興的非編碼RNA分子，與傳統的線性RNA不同，circRNA的分子結構呈封閉環狀，不含有5′和3′末端，不易被核酸內切酶降解，具有一定的組織特異性。目前，對于circRNA作為肺癌標志物的研究報道較少。研究報道［2］hsa_cir?cRNA_100855為鼻咽癌circRNA芯片中顯著高表達的基因，且hsa_circRNA_100855可作為鼻咽癌新的非編碼RNA標志物。經GEO數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）及circBase數據庫（http：//www.circbase.org/）的 查 找 及 分 析 可 知 ，hsa_cir?cRNA_100855與 has_circ_0023033為同一個cir?cRNA，簡稱circ0023033。本研究主要尋找鼻咽癌新的circRNA標志物在同為呼吸系統腫瘤肺癌中的表達，探究其是否具備作為肺癌診斷標志物的潛力。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與細胞

1.1.1 主要儀器 超凈工作臺（1300 Series A2，Thermo Scientific），CO2細胞培養箱（Thermo Scien?tific），-80℃超低溫冰箱（Thermo Scientific），液氮罐（Thermo Scientific），電熱恒溫水浴箱（蘇州長風），制冰機（SM?F123 SANYO），倒置顯微鏡（Nikon），冰箱（Haier，Samsung），AB?7500實時PCR儀（Applied Biosystems），BG?thermo RT恒溫儀（BAYgene）ND?1000紫外/可見分光光度計（Nano?drop Tecnologies）。

1.1.2 主要試劑 MEM培養基、DMEM培養基、RPMI?1640培養基、胎牛血清、DMSO、胰蛋白酶、青?鏈霉素雙抗（Gibco），TRIzol裂解液（Invitro?gen），GoScript Reverse Transcription System、GoTaq qRCR Master Mix（Promega），microRNA 試 劑 盒（GeneCopoeia）。

1.1.3 細胞系 人永生化支氣管黏膜上皮細胞（BEAS?2B），人肺癌細胞（H661、H1299、SK?MES?1）來自廣州伯信生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 BEAS?2B細胞使用含10%胎牛血清和1%青?鏈霉素雙抗的DMEM培養基培養，H661和H1299細胞使用含10%胎牛血清和1%青?鏈霉素雙抗的 RPMI?1640 培養基培養，SK?MES?1細胞使用含10%胎牛血清和1%青?鏈霉素雙抗的MEM培養基培養。培養條件為37℃、5%CO2培養箱正常培養。當細胞融合度達到80%左右時，使用胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 常規細胞RNA提取 收集細胞后使用TRIzol進行裂解后，按照試劑盒說明書提取總RNA，而后使用Nanodrop?1000紫外/可見分光光度計測定RNA濃度，以及OD260/OD280，OD260/OD230的比值，將RNA分裝保存于-80℃，備用。

1.2.3 逆轉錄與熒光定量PCR 檢測circRNA和mRNA使用GoScript Reverse Transcription System試劑盒進行逆轉錄，嚴格執行操作說明書，每個樣的總RNA量為200 ng。熒光定量PCR使用GoTaq qRCR Master Mix試劑盒，內參基因為β?actin，總反應體系為20 μL。miRNA使用miRNA試劑盒進行逆轉錄和熒光定量PCR，內參基因為U6，總反應體系為25 μL。

基因引物均由Life公司合成，其中circRNA根據其頭尾拼接位點設計特異性引物。本研究涉及的基因引物序列見表1、2。

表1 circRNA、mRNA及內參基因引物序列Tab.1 Primer sequence of circRNA，mRNA and internal reference gene

1.2.4 生物信息學分析 使用RegRNA（http：//re?grna.mbc.nctu.edu.tw/）預測與 circ0023033 結合的miRNA，使用 Targetscan（http：//www.targetscan.org/）預測miRNA下游的mRNA。

1.3 統計學方法 所有試驗至少重復3次，結果使用2^?ΔΔCt法表示基因的相對表達量，ΔΔCt=（Ct目的基因?Ct內參）處理組?（Ct目的基因?Ct內參）對照組。目的基因相對表達量（處理vs對照）=2^?ΔΔCt。數據采用 SPSS 22.0 進行統計學分析，試驗數據以均數±標準差表示。兩組間比較，滿足正態分布且方差齊的采用雙側Student'st檢驗，雙側檢驗以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 circ0023033在不同肺癌細胞株中低表達利用circ0023033的特異性引物在BEAS?2B細胞及不同肺癌細胞（H661、H1299、SK?MES?1）中進行檢測發現，circ0023033在H661、H1299、SK?MES?1細胞中高表達，在H1299細胞中差異表達最顯著。差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

表2 miRNA引物序列Tab.2 Primer sequence of miRNA

圖1 circ0023033在不同肺癌細胞中相對表達量Fig.1 Relative expression of circ0023033 in different lung cancer cells

2.2 circ0023033結合的多個miRNA在肺癌細胞中的表達 選擇了18個miRNA，在BEAS?2B細胞及肺癌細胞H1299中進行檢測發現，與BEAS?2B細胞進行比較，14個miRNA（miR?1182，miR?143，miR?2115，miR?4252，miR?4318，miR?516b，miR?93，miR?1256，miR?181a?2，miR?4299，miR?432，miR?520f，miR?128，miR?433）在H1299細胞中低表達，4個miRNA在H1299細胞中高表達。差異均具有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 生物信息學分析 通過生物信息學分析網站RegRNA，預測到與circ0023033結合的多個miR?NA。經查閱相關文獻預測到的結合強度選擇miR?143，運用生物信息學分析網站Targetscan預測其靶向的mRNA。在預測的mRNA中選擇了4個腫瘤診斷標志物進行進一步檢測研究。見圖3。

圖2 miRNA在肺癌細胞中相對表達量Fig.2 Relative expression of miRNA in lung cancer cells

2.4 circ0023033經miRNA靶向的多個腫瘤診斷標志物mRNA在肺癌細胞中的表達 通過對miR?143靶向mRNA進行篩選后，選擇了其中4個腫瘤標志物（BCL2、KRAS、SMAD3、MAPK1），運用RT?qPCR進行檢測發現：與BEAS?2B細胞進行比較，BCL2、KRAS、SMAD3和MAPK1的mRNA在H1299細胞中均顯著高表達，這與4種腫瘤標志物本身的功能一致。差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

肺癌是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，近些年來其發病率呈現逐漸上升態勢。目前肺癌的治療手段主要為手術切除和常規放/化學治療，患者預后十分嚴峻，5年生存率僅為11%。另一方面，由于缺少早期診斷的依據，肺癌患者確診時腫瘤細胞往往已經發生了轉移，這也是導致肺癌患者預后不良的主要因素。越來越多的研究報道表明［3］，基因表達與調控功能異常是肺癌發生和發展的內因和基礎。其中非編碼RNA的表達異常與肺癌的發生發展有著密切的關系。JIANG等［4］報道hsa_circ_0007385可以促進非小細胞肺癌（NSCLC）的發生和發展。

圖3 生物信息學分析Fig.3 Bioinformatics analysis

圖4 mRNA在肺癌細胞中相對表達量Fig.4 The relative expression of mRNA in lung cancer cells

circRNA的研究雖然目前仍處于起步階段，但是其具有非常重要的生物學功能。大量的研究報道表明［5］，circRNA幾乎參與了整個生物過程，其在轉錄、翻譯以及反轉錄過程中均發揮了不容忽視的作用。circRNA不僅在生物過程中發揮作用，還參與了多種疾病的發生發展。眾多研究表明［6］，circRNA在許多腫瘤組織與其癌旁組織中的表達具有特異性，因而具有作為新一類腫瘤標志物的潛力。YU等［7］報道circRNAcSMARCA5可充當 miR?17?3p 和 miR?181b?5p“海綿”，進而調控TIMP3的表達，最終抑制肝癌發生發展。ZHUANG等［8］報道的circRNA_0005836在活動性肺結核患者外周血單核細胞中明顯下調，可以作為活動性肺結核的新的診斷標志物和治療靶點。本研究從文獻查找到的鼻咽癌circRNA芯片中高表達的circ0023033入手，探究其在肺癌細胞中的作用。通過在不同肺癌細胞株中檢測發現，circ0023033均為高表達，尤以H1299細胞中最為顯著，提示該基因可能具有癌基因的作用。為進一步探究circ0023033在肺癌細胞中如何發揮癌基因的作用，筆者使用生物信息學網站預測到了其下游靶向與腫瘤相關的18個miRNA。經RT?qPCR驗證發現，14個miRNA在H1299細胞中低表達，4個miRNA 高表達。進一步查閱文獻［9?10］結合預測到的結合強度，最終選取miR?143進行下一步探究。而后筆者經生物信息學網址預測到其下游靶向的4個mRNA，經RT?qPCR驗證發現，BCL2、KRAS、SMAD3和MAPK1在H1299細胞中均顯著高表達，這與文獻報道中4種腫瘤標志物本身的功能一致［11?14］。筆者分析原因認為，circ0023033在肺癌細胞中高表達之后，對其靶向的miRNA吸附作用增強，導致其靶向的miR?143表達下調，miR?143下游靶向的BCL2、KRAS、SMAD3和MAPK1表達上調。

circRNA作為肺癌標志物的研究報道較少，本研究通過對circ0023033在肺癌細胞中的表達和其對下游靶基因的影響檢測發現，circ0023033具備作為新的肺癌診斷標志物能力，也為進一步探究肺癌診斷方法提供了新的線索。