葡萄糖對滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)脂素表達(dá)的影響

張艷紅 尹曉茜 霍琰 王潤芳 邢邯英 劉素新

河北省人民醫(yī)院1產(chǎn)科，3臨研中心（石家莊 050051）；2河北北方學(xué)院研究生院（河北張家口 075000）

內(nèi)脂素（visfatin）是一種主要由胎盤和內(nèi)臟脂肪組織表達(dá)和分泌的脂肪細(xì)胞因子，可參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，參與糖脂代謝，還與胰島素抵抗（IR）和妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）發(fā)病密切相關(guān)。然而GDM患者visfatin水平升高或降低，及visfatin在GDM發(fā)病機(jī)制中的作用仍存在爭議。

過氧化物酶增殖物激活受體（PPAR?γ）是一種細(xì)胞核受體，國外一項(xiàng)研究表明，在人巨噬細(xì)胞中PPAR?γ參與誘導(dǎo)visfatin基因表達(dá)［1］，而在滋養(yǎng)細(xì)胞PPAR?γ是否參與visfatin表達(dá)的調(diào)節(jié)，國內(nèi)外未見研究和報(bào)道。c?Jun氨基末端激酶（JNK）屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，能夠被多種細(xì)胞因子和應(yīng)激激活，如：紫外線照射、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、炎癥因子等，被認(rèn)為是聯(lián)系炎癥和IR的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子［2］。本研究以葡萄糖作用于人滋養(yǎng)細(xì)胞（BeWo）觀察visfatin、PPAR?γ及p?JNK表達(dá)的變化，探討葡萄糖對visfatin表達(dá)的調(diào)節(jié)及是否通過PPAR?γ和JNK通路，旨在發(fā)現(xiàn)GDM發(fā)病的分子機(jī)制和尋找GDM的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組及方案 接種BeWo細(xì)胞（購自中國協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞中心）于六孔板中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，于對數(shù)生長期分別加入不同濃度的葡萄糖（0，5.5，10，30 mmol/L，Sigma公司）作用48 h，提取RNA，RT?PCR檢測細(xì)胞visfatin、PPAR?γ mRNA表達(dá)；接種BeWo細(xì)胞于25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，于對數(shù)生長期加入不同濃度的葡萄糖作用48 h，提取總蛋白，Western?blot檢測細(xì)胞visfatin、PPAR?γ及p?JNK蛋白表達(dá)；留取干預(yù)后的培養(yǎng)液，ELISA檢測visfatin的分泌水平。

1.2 檢測指標(biāo)和方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT?PCR）檢測各組細(xì)胞visfatin、PPAR?γ mRNA表達(dá) 葡萄糖作用48 h后，每孔加入1 mL Trizol（Invitrogen公司）提取總RNA，各加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水40 μL，分別測定吸光度A260和A280值計(jì)算純度及濃度，A260/A280均在 1.8 ～ 2.0；按 FastQuant RT Kit試劑盒（TIANGEN公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；參照試劑盒說明建立PCR反應(yīng)體系，PowerUpTMSYBR Green Master Mix（ABI公司）10 μL，F(xiàn)orward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，cDNA 8 μL，共20 μL反應(yīng)體系，GAP?DH正向引物：5′?TGAACGGGAAGCTCACTG?3′，反向引物：5′?GCTTCACCACCTTCTTGATG?3′；PPAR?γ 正向引物：5′?GCCCTTCACTACTGTTGACTTCT?3′，反向引物：5′?CAGGCTCCACTTTGATTGC?3′；visfatin 正向引物：5′?TTGCCTTCGGTTCTGGTGGA?3′，反向引物：5′?AATTCCCTGCTGGCGTCCTA?3′采用ABI公司7300型熒光定量PCR儀檢測visfatin、PPAR?γ mRNA相對表達(dá)量RQ值。

1.2.2 蛋白印跡（Western blot）法檢測各組細(xì)胞中visfatin、PPAR?γ及p?JNK蛋白表達(dá) 用預(yù)冷的PBS洗滌干預(yù)好的貼壁細(xì)胞2次，細(xì)胞刮收集細(xì)胞至離心管中，離心后加入RIPA裂解液（含1%的PMSF和蛋白磷酸酶抑制劑），4℃裂解1 h，12 000 r/min，4℃離心30 min，BCA法測蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行10%聚丙烯凝膠電泳，濕法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2～4 h，按合適比例加入一抗稀釋液（GAPDH抗體1∶5 000，visfatin抗體1∶250，PPAR?γ抗體1∶1 000，JNK 及p?JNK抗體1∶500稀釋，各抗體屬性均為兔抗），4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜后加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體（SAB公司），室溫孵育1 h，最后用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測各蛋白表達(dá)。圖片灰度值采用IMAGE J軟件分析，以目的蛋白灰度值除以內(nèi)參灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表該目的蛋白相對含量。抗體visfatin、PPAR?γ、JNK、p?JNK由Abcam公司提供。內(nèi)參抗體GAPDH由Bioworld公司提供。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中visfatin分泌水平 按人visfatin ELISA試劑盒（ImmunoWay Biotechnology公司）說明檢測visfatin的分泌水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以表示。進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，各組間變量比較，采用單因素方差分析和 Student?Newman?Keuls post?hoc 兩兩檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度葡萄糖對BeWo細(xì)胞visfatin、PPAR?γ mRNA表達(dá)的影響 與對照組相比，不同濃度的葡萄糖作用于BeWo細(xì)胞48 h后，visfatin mRNA表達(dá)均升高，呈濃度依賴性；PPAR?γ mRNA表達(dá)，僅30 mmol/L組明顯升高（P＜0.05）。見圖1。相關(guān)性分析表明，visfatin與PPAR?γ mRNA表達(dá)正相關(guān)（r=0.686，P=0.014）。

圖1 葡萄糖作用48 h后visfatin和PPAR?γ mRNA表達(dá)結(jié)果Fig.1 The mRNA expression of visfatin and PPAR?γ affected by glucose for 48 h

2.2 不同濃度葡萄糖對BeWo細(xì)胞visfatin、PPAR?γ、p?JNK蛋白表達(dá)的影響 不同濃度葡萄糖作用于BeWo細(xì)胞48 h后，visfatin蛋白表達(dá)升高，呈濃度依賴性；PPAR?γ蛋白表達(dá)在不同濃度組呈降低趨勢，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；葡萄糖對JNK蛋白表達(dá)及磷酸化無明顯影響。見圖2。

2.3 不同濃度葡萄糖對BeWo細(xì)胞visfatin分泌的影響 BeWo細(xì)胞visfatin分泌水平較低，與對照組比較，各濃度葡萄糖組其分泌均無顯著差異。見圖3。

圖2 各組細(xì)胞visfatin、PPAR?γ及p?JNK蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.2 The protein expression of visfatin、PPAR?γ and p?JNK in BeWo cells

圖3 各濃度組visfatin分泌水平Fig.3 The secretion levels of visfatin in all groups

3 討論

多數(shù)研究表明［3-5］，GDM患者visfatin水平升高。有學(xué)者認(rèn)為GDM患者visfatin表達(dá)降低［6］。另有研究［7］顯示，GDM患者孕中期血清visfatin水平無變化。雖然存在爭議，但均認(rèn)為visfatin與GDM相關(guān)，但其具體作用機(jī)制還未闡明。關(guān)于visfatin與GDM的關(guān)系，目前國內(nèi)外絕大多數(shù)都基于體內(nèi)研究，本研究以BeWo細(xì)胞為模型，在細(xì)胞水平探討葡萄糖對visfatin表達(dá)的影響及機(jī)制。該細(xì)胞系來源于人胎盤絨毛膜癌細(xì)胞，各項(xiàng)主要特征與滋養(yǎng)細(xì)胞類似，可在細(xì)胞水平提供胎盤的綜合信息［7］。

本研究首次以葡萄糖干預(yù)模擬GDM患者高血糖模型，結(jié)果顯示葡萄糖可促進(jìn)BeWo細(xì)胞visfatin基因和蛋白表達(dá)，呈濃度依賴性，而對其分泌無明顯影響。國內(nèi)馬瑤等［8］研究表明TNF?α作用于BeWo細(xì)胞后，其胞內(nèi)visfatin表達(dá)降低，而胞外分泌增加，呈劑量依賴性，從而認(rèn)為visfatin主要作為炎癥因子參與GDM發(fā)病。本實(shí)驗(yàn)葡萄糖對BeWo細(xì)胞visfatin分泌無明顯影響，且其分泌水平較低，表明高糖不能直接誘導(dǎo)visfatin分泌，雖然可促進(jìn)visfatin基因和蛋白表達(dá)，但對JNK蛋白表達(dá)及磷酸化無明顯影響，從而證明高糖不能通過JNK通路參與對BeWo細(xì)胞visfatin表達(dá)的調(diào)節(jié)。提示GDM患者JNK介導(dǎo)炎癥和IR的機(jī)制，不能由高糖直接引起，可能是因肥胖和GDM孕婦體內(nèi)IL?6、TNF?α等炎癥因子水平升高，這些炎癥因子通過激活JNK通路參與IR，還需今后進(jìn)一步研究。

最近，有研究［9］認(rèn)為胞外內(nèi)脂素發(fā)揮促炎和致動(dòng)脈粥樣硬化作用，而其胞內(nèi)作用與之相反，其胞內(nèi)外功能的不同可能與胞內(nèi)外煙酰胺腺嘌呤二核苷（NAD）的作用有關(guān)，胞內(nèi)NAD可激活脫乙酰酶（sirtuins），通過組蛋白的脫乙酰作用調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，而胞外NAD可結(jié)合并激活胞外受體從而引發(fā)炎癥反應(yīng)。Visfatin也叫煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Nampt），是NAD生物合成的限速酶，NAD是一種重要的輔酶，參與多種氧化還原反應(yīng)，通過電子轉(zhuǎn)移參與ATP生成，對維持機(jī)體能量代謝起重要作用［10］。NAD還可通過調(diào)節(jié)依賴NAD的sirtuin?1活性上調(diào)脂聯(lián)素的生物合成，進(jìn)而改善肝臟、脂肪組織和骨骼肌對胰島素的敏感性［11-12］。Sirtuin?1還可增加由葡萄糖刺激的胰腺β細(xì)胞胰島素分泌［13］，當(dāng)visfatin表達(dá)降低時(shí)可損害胰島素分泌，進(jìn)而使血糖調(diào)節(jié)受損。本研究顯示高糖狀態(tài)下，BeWo細(xì)胞visfatin表達(dá)增加，可能通過反饋機(jī)制增加胰島素分泌，維持血糖平衡。此外，visfatin還具有胰島素模擬活性，能與胰島素受體結(jié)合發(fā)揮降糖作用［5，14-15］。

本研究表明，高糖主要促進(jìn)BeWo細(xì)胞內(nèi)visfatin表達(dá)，而對其分泌無明顯影響，由此推測GDM患者胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞visfatin表達(dá)上調(diào)主要對維持滋養(yǎng)細(xì)胞能量代謝和胎盤功能起重要作用，還可通過調(diào)節(jié)NAD的合成和sirtuin?1的活性維持血糖平衡，作為GDM的保護(hù)因子。本研究發(fā)現(xiàn)高糖促進(jìn)BeWo細(xì)胞visfatin和PPAR?γ mRNA表達(dá)，且二者表達(dá)正相關(guān)。國外一項(xiàng)研究［1］表明，在人巨噬細(xì)胞visfatin是PPAR?γ的一個(gè)靶基因，其配體可以PPAR?γ依賴方式上調(diào)visfatin的表達(dá)。因此，噻唑烷二酮類藥物可通過激活PPAR?γ來上調(diào)visfatin表達(dá)，可能為GDM的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究表明高糖可促進(jìn)BeWo細(xì)胞visfatin基因和蛋白表達(dá)，PPAR?γ可能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)visfatin的表達(dá)，但其對visfatin及糖代謝的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。