Reversine對(duì)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控及相關(guān)作用機(jī)制的研究

黃迪 黃宇 翁杰鋒 黃子圣 麥振豪 趙俐 古維立

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院普通外科（廣州510180）；2廣州消化疾病中心（廣州510180）；3華南理工大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科（廣州510180）

乳腺癌是一種嚴(yán)重危害女性健康的常見惡性腫瘤。近40年來(lái)，乳腺癌的發(fā)病率位居全球首位，全球每年有140萬(wàn)婦女被確診為乳腺癌［1］。近幾十年來(lái)，盡管放療、化療及多種生物治療手段有了長(zhǎng)足發(fā)展，然而，乳腺癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及化療耐藥等仍是乳腺癌治療的難題。有證據(jù)表明［2-4］，reversine可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但是目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用reversine作用乳腺癌的研究極為少見，特別是用于三陰性乳腺癌41T細(xì)胞的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究旨在探討rever?sine對(duì)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，并探究其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞株（中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）；藥物reversine（SIMGA公司）；CCK?8試劑盒（上海東仁化學(xué)科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基干粉、胎牛血清、DMSO（美國(guó)Sigma公司）；TGF?beta、TIMP1、MMP9抗體（Abcam公司）；Caspase?3、bax、bcl?2 抗體（Cell Signaling公司）；Aurora B 抗體（Novusbio公司）；Annexin?V?FITC/PI凋亡試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；RIPI裂解液（碧云天生物技術(shù)公司）；Millipore聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、電化學(xué)（ECL）發(fā)光液、垂直電泳槽、Western blot電泳儀、Western blot轉(zhuǎn)膜儀、FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；多功能酶標(biāo)儀（香港基因有限公司）；IX51倒置相差顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 4T1細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清加1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，于二氧化碳培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)，隔天換液，傳代時(shí)間為3～4 d，傳代前用2.5 g/L的胰酶消化。以加入DMSO的4T1細(xì)胞作為正常對(duì)照組；以reversine終濃度分別為 10、25、50 μg/mL 為實(shí)驗(yàn)組，每組藥物干預(yù)時(shí)間為24 h。

1.2.2 CCK?8法檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，設(shè)立空白對(duì)照組，24 h后加入CCK?8試劑，與培養(yǎng)基按1∶10的比例加入，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm處的吸光度OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞抑制率計(jì)算方法：細(xì)胞抑制率=1-（加藥組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，按照分組情況加入藥物干預(yù)，24 h后胰酶消化收集細(xì)胞，1×PBS洗滌細(xì)胞2次，制成細(xì)胞懸液，用300目濾網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，計(jì)數(shù)取1×105個(gè)細(xì)胞，離心后用500 μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V?FITC以及5 μL PI，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)完成檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 分別收集各組細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)后，進(jìn)行SDS?PAGE電泳（分離膠10%，濃縮膠5%），每孔加入50 μg蛋白質(zhì)，恒壓100 V電泳至分離膠底部，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶室溫封閉1 h，按照抗體說(shuō)明書稀釋抗體，4℃孵育過(guò)夜，PBST洗滌3次，每次15 min。再加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫?fù)u床振搖1 h，PBST洗滌3次，ECL試劑顯色、曝光并拍照，掃描后用Image?Pro?Plus圖像分析軟件進(jìn)行光密度積分值（Integral of optical density）分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 13.0軟件，多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析（One?way ANOVA），數(shù)據(jù)均以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 reversine對(duì)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖抑制作用 如圖1所示，隨著濃度的增加，reversine對(duì)4T1細(xì)胞的抑制率也隨之增加，在同一濃度下，reversine干預(yù)48 h比干預(yù)24 h對(duì)細(xì)胞的抑制更強(qiáng)，呈現(xiàn)時(shí)間劑量對(duì)應(yīng)關(guān)系。不同濃度reversine對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響見圖2。

圖1 reversine對(duì)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.1 Effect of reversine on proliferation of mouse breast cancer 4T1 cells

2.2 reversine對(duì)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞凋亡率的影響 流式細(xì)胞檢測(cè)凋亡結(jié)果如圖3，不同濃度reversine對(duì)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率的情況見表1。低濃度組（10 μg/mL）細(xì)胞早期、晚期以及總凋亡率有所增加，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中濃度組（25 μg/mL）及高濃度組（50 μg/mL）細(xì)胞早期、晚期以及總凋亡率明顯增加，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 Caspase?3、bax、bcl?2 蛋 白 表 達(dá)的變化Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中 Caspase?3、bax、bcl?2蛋白表達(dá)如圖4所示，利用IPP圖像分析軟件對(duì)各蛋白條帶定量，結(jié)果（圖5）應(yīng)用reversine能夠顯著增加活化的Caspase?3的表達(dá)，隨著加藥濃度的增加bax/bcl?2的比值也增大。

圖2 reversine對(duì)4T1細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.2 Effect of reversine on mouse breast cancer 4T1 cells

圖3 reversine對(duì)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞凋亡率的影響Fig.3 Effect of reversine on apoptosis of mouse breast cancer 4T1 cells

表1 不同濃度reversine對(duì)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率的影響Tab.1 Flow cytometry was adopted to detect the effect of reversine on the apoptosis of mouse breast cancer 4T1 cells

圖4 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Caspase?3、bax、bcl?2蛋白的表達(dá)情況Fig.4 Western blot was conducted to detect the expression of Caspase?3，bax，bcl?2 protein

圖5 活化的Caspase?3和bax/bcl?2比值定量分析情況Fig.5 Expression of Caspase?3 and bax/bcl?2 ratio of reversine on mouse breast cancer 4T1 cells

2.4TGF?β1、TIMP1、MMP9和Aurora B蛋白表達(dá)情況 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中TGF?β1、TIMP1、MMP9和Aurora B蛋白表達(dá)（圖6），利用IPP圖像分析軟件對(duì)各蛋白條帶定量，結(jié)果（圖7）發(fā)現(xiàn)應(yīng)用reversine后 TGF?β1表達(dá)無(wú)差別，rever?sine能夠下調(diào)4T1細(xì)胞中TIMP1、MMP9和Aurora B蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

Reversine是一種人工合成的小分子的嘌呤衍生物，它可以令已分化的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槲捶只淖婕?xì)胞［5］，這一特性使得該藥物在再生醫(yī)學(xué)方面受到廣泛關(guān)注［6-10］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)reversine在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)具有抗腫瘤作用，對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞［2，4］、口腔鱗狀細(xì)胞癌［3］、宮頸癌［11］、骨髓癌［12］等的治療具有一定作用。

圖6 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中TGF?β1、TIMP1、MMP9和Aurora B蛋白的表達(dá)情況Fig.6 Western blot was conducted to detect the expression of TGF?β1，TIMP1，MMP9 and Aurora B protein

4T1細(xì)胞是一種雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（Her?2）均為陰性的乳腺癌細(xì)胞。三陰性乳腺癌發(fā)病年齡小，最具侵襲性、轉(zhuǎn)移率高且預(yù)后不良，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)的化療治療預(yù)后較差，仍為臨床上治療的難點(diǎn)。雖現(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)具有BRCA1/2基因變異的三陰性乳腺癌應(yīng)用鉑類效果較佳，但三陰性乳腺癌仍為當(dāng)今乳腺癌治療的挑戰(zhàn)。本研究利用reversine對(duì)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)reversine可以抑制小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖，高濃度組（50 μg/mL）處理48 h后，50%的細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。Aurora B是一種促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的關(guān)鍵蛋白，既往針對(duì)reversine的研究發(fā)現(xiàn)該藥物是通過(guò)Aurora B這一通路使細(xì)胞去分化。本實(shí)驗(yàn)中west?ern blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)reversine能顯著下調(diào)4T1細(xì)胞Aurora B蛋白的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)reversine可以促進(jìn)4T1細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與促進(jìn)活化的 Caspase?3 表達(dá)、增加 bax/bcl?2比值有關(guān)。

圖7 TGF?β1、TIMP1、MMP9和Aurora B蛋白定量分析Fig.7 Expression of TGF?β1，TIMP1，MMP9和Aurora B protein of reversine on mouse breast cancer 4T1 cell

乳腺癌轉(zhuǎn)移是多步驟發(fā)展的過(guò)程，表現(xiàn)為：具有侵襲轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞脫離原發(fā)灶開始浸潤(rùn)周圍組織，穿透血管壁進(jìn)入血液，通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，最后在遠(yuǎn)處器官上形成新的轉(zhuǎn)移灶。現(xiàn)階段的研究發(fā)現(xiàn)影響乳腺癌轉(zhuǎn)移的因素包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF?β）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、組織金屬蛋白酶抑制物（TIMPs）和外泌體等。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF?β1是人體組織細(xì)胞內(nèi)具有調(diào)控功能的細(xì)胞因子，在細(xì)胞增殖及凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［13］，既往的研究也發(fā)現(xiàn)rever?sine對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)制與TGF?β1相關(guān)［14］。有研究表明TGF?β1的表達(dá)與多種惡性腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)［15-17］。本研究發(fā)現(xiàn)reversine對(duì)4T1細(xì)胞TGF?β1的表達(dá)沒(méi)有影響。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是其難以根治的主要原因，基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs與TIMPs間活性的平衡決定著細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解與否。有研究表明，MMP9和TIMP1表達(dá)失衡與乳腺癌浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［18-19］，乳腺癌組織中的TIMP1含量越高其預(yù)后越差［20］。本研究通過(guò)應(yīng)用reversine干預(yù)4T1細(xì)胞，了解reversine作用乳腺癌的相關(guān)機(jī)制，結(jié)果顯示reversine可以顯著減低4T1細(xì)胞中MMP9和TIMP1蛋白的表達(dá)，提示re?versine有可能通過(guò)下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中MMP9和TIMP1蛋白的表達(dá)來(lái)減少細(xì)胞侵襲，但具體通路尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，reversine可以抑制小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，reversine可能成為一種治療乳腺癌的潛在藥物，其具體的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。