外周血CD4+T細胞Foxp3基因CNS2去甲基化與絕經后骨質疏松癥的關系

李子祺 葛鴻慶 王君鰲 王慧敏 胡杏平 陳文治

廣東省中醫院芳村醫院骨科（廣州510120）

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporo?sis，PMO）是指絕經后婦女由于卵巢功能衰退，雌激素水平下降，導致骨吸收-骨形成失衡，出現以骨強度下降、骨折風險增加為特征的骨骼系統疾病［1-3］。PMO患者骨骼中骨小梁的強度、密度和數量發生顯著的改變，其血液循環及骨髓腔內的微環境中的炎癥相關細胞及促炎癥細胞因子的數量與成分也顯著提高。在炎癥狀態下，多種免疫細胞可通過釋放炎癥因子促進破骨細胞形成［4］。

調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）是CD4+T細胞的重要亞群，在多種自身免疫性疾病中起到抑制炎癥作用［5］。大量研究［6-11］表明Treg細胞通過抑制破骨細胞活性進而參與了骨代謝調節。Foxp3基因保守非編碼序列2（conserved noncoding sequence 2，CNS2）的低甲基化狀態是Treg細胞分化并發揮免疫抑制功能的前提［5，12-13］。本研究觀察了PMO患者外周血CD4+T細胞中Foxp3 CNS2去甲基化水平，及其與骨代謝指標的相關性，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年7月至2015年7月我院收治的PMO患者42例為觀察組，38例絕經后骨量正常婦女作為對照組，記錄入組病例年齡、身高、體質量、體質指數等一般資料。本研究經過本院醫學倫理委員會批準，所有患者知情同意。

1.2 納入及排除標準

1.2.1 納入標準 PMO的診斷標準參考WHO推薦標準［3］，DXA測定骨密度值低于同性別、同種族健康成人的骨峰值不足1個標準差為正常（T值≥-1.0 SD）；降低1～2.5個標準差為骨量低下或骨量減少（-2.5 SD＜T值＜-1.0 SD）；降低程度≥2.5個標準差為骨質疏松（T值≤-2.5 SD）；降低程度符合骨質疏松診斷標準，同時伴有一處或多處骨折為嚴重骨質疏松。根據診斷標準，絕經后婦女DXA測定骨密度測定中T值≤-2.5 SD則診斷為PMO，納入觀察組。絕經后婦女T值≥-1.0 SD則納入對照組。

1.2.2 排除標準 （1）合并可能影響骨代謝的內分泌疾病，如糖尿病、甲狀腺功能亢進、甲狀旁腺功能亢進等；（2）罹患慢性胃炎、腸炎、派杰氏病，以及骨與其他組織惡性腫瘤患者；（3）合并肝腎功能異常；（4）合并類風濕性關節炎、強直性脊柱炎等免疫性疾病；（5）6個月內使用過糖皮質激素或其他影響骨代謝的藥物；（6）1年內出現骨折或其他原因導致的運動障礙的患者。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清Ⅰ型前膠原氨基端前肽（P1NP）、β膠原特殊序列（β?crosslaps）及血Ca2+測定 所有患者清晨空腹抽取靜脈血2 mL，利用美國Bio?Rad酶聯免疫檢測儀測定骨代謝生化標志物P1NP、β?crosslaps，試劑盒由武漢云克隆科技股份有限公司提供。使用美國羅氏公司生產的Cobas 8000酶標儀檢測血Ca2+，試劑盒由中國中生北控生物科技有限公司提供。

1.3.2 外周血CD4+T細胞分離 將抽取的新鮮抗凝血轉移至15/50 mL離心管內，按每1 mL全血加入 50 μL 的比例加入 Human CD4+T cell Enrich?ment Cocktail（Stemcell，15022），輕輕混勻。室溫靜置20 min。向離心管內加入等體積含2%FBS的PBS混勻，稀釋血液。將稀釋的血液滴加至淋巴細胞分離液液面上。于室溫1 200 g離心20 min；小心從分離液：血漿中間層吸取富集的CD4+T細胞至一新離心管內。用PBS+2%FBS洗滌細胞1次。重復此步驟1次。加RPMI 1640培養基（含10%FBS+1%Pen/Strep）重懸細胞，并調整細胞密度，于37℃，5%CO2培養箱中培養。

1.3.3 實時定量PCR檢測外周血CD4+T細胞Foxp3 mRNA表達 使用Trizol一步法提取細胞總RNA，逆轉錄后得到cDNA（試劑盒DBI?2220），以GAPDH為內參基因，行實時定量PCR法（試劑盒Genecopies，AOPR?1200），Foxp3正義引物5′?CA?CTCACCTCACTCCCATTC?3′，反義引物 5′?GGGCC?TTGGATCCCAAATAA?3′。PCR反應條件95℃預變性10 min；95℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸35 s，共40個循環。每個樣本重復檢測兩次。Foxp3 mRNA相對表達量以2-△△Ct表示。

1.3.4 亞硫酸氫鹽測序法檢測外周血CD4+T細胞Foxp3 CNS2甲基化 按照DNA提取試劑盒（Tian?gen，DP304）說明書進行操作，對所提取DNA進行定量分析后嚴格按照試劑盒說明書操作，取基因組DNA 1 μg進行亞硫酸鹽轉化并純化回收。引物信息B281?F：TTGGGTTAAGTTTGTTGTAGGATAG；B281?R：ACATCTAAACCCTATTATCACAACC。在50 μL體系進行PCR擴增，PCR Mix 25 μL，上下游引物各 1 μL，模板 DNA 2 μL，補水至 50 μL。PCR產物純化按照試劑盒中的產品說明操作，將目標片段割膠純化（Generay，cat：GK2043）。采用Generay的pTG19?T作為載體，按照試劑盒中的產品說明操作，轉化采用XL10?Gold感受態，按照產品說明進行轉化、復蘇和涂板。酶切法鑒定陽性菌落挑取質粒送測序。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差表示，根據數據是否符合正態分布，組間比較分別采用獨立樣本t檢驗或 Mann?WhitneyU檢驗；Pear?son相關性檢驗分析PMO中骨代謝指標與CD4+T細胞Foxp3 mRNA相對表達量、Foxp3 CNS2去甲基化的關系。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較 觀察組共納入PMO患者42例，平均年齡（57.9±7.5）歲；對照組納入絕經后無骨質疏松癥患者38例，平均年齡（56.0±5.0）歲。兩組患者年齡、身高、體質量、體質指數等一般資料比較差異均無統計學意義（表1）。

2.2 兩組患者外周血CD4+T細胞Foxp3 mRNA相對表達量、Foxp3 CNS2去甲基化率比較 觀察組Foxp3 mRNA相對表達量0.9±0.3，顯著低于對照組1.8±0.6，其差異具有統計學意義（z=-7.1，P＜0.01）。觀察組Foxp3 CNS2去甲基化率為（7.3±1.3）%，顯著低于對照組（9.6±1.4）%，其差異具有統計學意義（t=-7.4，P＜0.01）。根據Pearson相關性分析，所有患者外周血CD4+T細胞Foxp3 CNS2位點非甲基化率與Foxp3 mRNA相對表達量呈正相關，其相關性差異具有統計學意義（r=0.5，P＜0.01）。見圖1。

表1 兩組患者一般資料對比Tab.1 Comparison of demographic characteristics between two groups ±s

表1 兩組患者一般資料對比Tab.1 Comparison of demographic characteristics between two groups ±s

組別觀察組對照組t值P值例數42 38年齡（歲）57.9±7.5 56.0±5.0 1.3 0.2身高（m）1.5±0.1 1.6±0.1-1.6 0.1體質量（kg）63.3±8.1 63.2±7.4 0.1 0.9體質指數26.5±3.5 25.7±3.7 1.0 0.3

圖1 PMO患者外周血CD4+T細胞Foxp3基因CSN2去甲基化程度比較Fig.1 Comparison of DNA methylation of Foxp3 CNS2 region in CD4+T cells between patients with postmenopausal osteoporosis and control group

2.3 PMO中骨代謝指標與CD4+T細胞Foxp3 mRNA相對表達量、Foxp3 CNS2去甲基化的關系 觀察組與對照組血清PINP含量分別為（43.6±4.0）ng/mL與（24.0±3.6）ng/mL，觀察組PINP含量顯著高于對照組，其差異具有統計學意義（t=23.6，P＜0.01）。觀察組血清β?crosslaps含量（1.2±0.2）ng/mL，顯著高于對照組（0.8±0.1）ng/mL，其差異具有統計學意義（z=6.7，P＜0.01）。觀察組與對照組血鈣含量分別為（2.4±0.2）mmol/L及（2.4±0.1）mmol/L，其差異無統計學意義（t=1.2，P=0.2）。根據Pearson相關性分析，PMO中外周血CD4+T細胞Foxp3 CNS2位點非甲基化率與β?crosslaps呈負相關，其相關性差異具有統計學意義（r=-0.5，P＜0.01）；CD4+T細胞Foxp3 CNS2位點非甲基化率與血清PINP含量無顯著的相關性（r=-0.1，P=0.6）；CD4+T細胞Foxp3 mRNA相對表達量與血清PINP（r=-0.2，P=0.2）、β?crosslaps含量（r=-0.1，P=0.6）均無顯著的相關性。

3 討論

絕經后婦女由于卵巢功能衰退，雌激素水平下降，導致骨代謝中破骨細胞介導的骨吸收作用增強，與成骨細胞介導的骨形成作用失衡，最終導致了骨質疏松癥。正常人體中90%的骨基質由Ⅰ型膠原組成。骨代謝指標PINP由成骨細胞分泌，是I型膠原形成的重要的代謝產物，與骨形成密切相關；而β?crosslaps是Ⅰ型膠原分解的產物，可作為骨吸收的重要指標［14］。本研究發現PMO患者外周血CD4+T細胞中Foxp3 CNS2位點去甲基化顯著降低，并且與血清中β?crosslaps含量呈負相關。這提示在PMO中Treg細胞可能通過抑制骨吸收作用參與骨代謝調節。

Treg細胞是CD4+T細胞的重要亞群，可通過細胞間直接接觸以及TGF?β、IL?4、IL?10等因子介導的間接途徑抑制破骨細胞，從而在骨代謝平衡中起到骨保護作用［9-10］。李文艷等［6］通過臨床研究發現在老年性骨質疏松癥患者中外周血中Treg細胞數量隨著年齡的增長而降低，推測Treg細胞的減少促進了骨質疏松癥的發生。而動物實驗發現Treg細胞占CD4+T細胞比例與骨質疏松大鼠骨密度呈正相關［7］。

Foxp3是Treg細胞區別于其他CD4+T細胞的特異性基因，其穩定表達是Treg細胞發揮骨保護作用的前提。ZAISS等［11］研究發現Foxp3轉基因小鼠（Foxp3?tg）的骨髓細胞能夠抑制腫瘤壞死因子轉基因小鼠體內由炎癥因子介導的骨破壞。LIU等［15］研究發現在絕經后骨質疏松的大鼠模型中Treg細胞數量顯著低于假手術組，而在脾及股骨局部的Foxp3蛋白表達顯著降低。越來越多的文獻表明，表觀遺傳因素與Foxp3的表達、Treg細胞分化與功能維持密切相關。其中Foxp3 CNS2去甲基化是Treg細胞特異的表觀遺傳標記［12］，也是Foxp3穩定表達的前提［13］。

本研究采用Foxp3 CNS2去甲基化程度來反應Treg細胞數量與功能，是因為部分CD4+T細胞能夠短暫地表達Foxp3，但并不具備類似Treg細胞的免疫抑制功能［16］。而少量Treg前體細胞Foxp3 CNS2位點去甲基化后即可獲得免疫抑制功能，即使暫無Foxp3表達［17］。因此相對于Foxp3基因mRNA的表達，Foxp3 CNS2去甲基化程度是反應外周血CD4+T細胞中Treg細胞比例的可靠指標，更為準確地反應了Treg細胞對骨吸收的抑制作用。本研究結果也印證了這一推論，雖然PMO患者中CD4+T細胞Foxp3 CNS2去甲基化程度與Foxp3基因mRNA的表達均顯著降低，但僅Foxp3 CNS2去甲基化程度與血清中β?crosslaps含量具有顯著負相關性。

本研究具有一定的局限性。本研究納入了42例PMO患者與38例絕經后無PMO婦女進行對照，由于PMO的發生與發展受多種因素影響，本研究的樣本數需進一步擴大，并通過多因素分析探討Foxp3 CNS2去甲基化水平與PMO的關系。另一方面，本研究為橫斷面研究，Foxp3 CNS2去甲基化水平與疾病發生發展的動態關系尚不明確，有待進一步研究。

綜上所述，本研究發現PMO外周血中CD4+T細胞中Foxp3 CNS2去甲基化水平顯著降低，且與血清β?crosslaps含量呈負相關。可見PMO中外周血中CD4+T細胞Foxp3 CNS2去甲基化水平是與骨代謝關系密切的生物標志，可能反應了Treg細胞對骨吸收的抑制作用。