液質聯用技術應用于分析化學實驗教學的探索

王 瑩， 丁 越， 王新宏， 張 彤

(上海中醫藥大學 a. 中藥學院; b. 教學實驗中心， 上海 201203)

0 引 言

分析化學是發展和和應用各種理論、方法、儀器和策略以獲得有關物質在空間和時間方面組成和性質信息的一門科學，是最早發展起來的化學分支學科，其在科學體系中的重要作用不言而喻。分析化學是高等學?；瘜W化工、生物學、材料學、醫藥學、環境科學等專業的主干基礎課程之一。分析化學課程體系中既有嚴密而系統的理論，還有很強的實用性，是理論與實際密切結合的學科。通過本課程的學習，學生不僅需要掌握分析化學的基本理論，更需要掌握不斷發展和更新的實驗方法。

液相色譜-質譜聯用技術集色譜的高分離能力與質譜的高靈敏度和高專屬性于一體，是當今分析化學中最重要的定性和定量分析技術之一[1]。液質聯用中色譜技術的優勢在于對待分析的混合物進行有效的分離，但色譜方法有時無法實現定性和定量的檢測功能，比如常規的紫外檢測器對無紫外吸收的化合物的檢測以及未知化合物的定性都無能為力。質譜法能提供豐富的分子量信息，并能夠同時監測化合物的母離子和子離子進行定量分析，因此具有較高專屬性和靈敏度。質譜法與色譜方法聯用，在藥物分析、食品分析和環境分析等領域得到了廣泛應用[2-5]。根據學校實驗教學要求，將前期成熟的科研成果應用于實驗教學中，形成“液相色譜-質譜聯用技術對中藥黃芩中黃芩苷和黃芩素的定性和定量分析”實驗課程教學內容，在實驗教學中取得了良好的效果。

1 實驗原理

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，味苦性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效。現代藥理研究表明，黃芩在抗炎、抗氧化、抗缺血再灌注損傷、調節免疫、保肝以及抗腫瘤等多方面具有潛在的開發應用價值[6-8]。黃酮類化合物是黃芩的主要藥效物質基礎。其中，黃芩苷和黃芩素含量較高，活性明確，是評價黃芩質量優劣的主要指標[9]。黃芩苷和黃芩素的分子式分別為C21H18O11、C15H10O5，化學結構式為：

黃芩苷Baicalin; mol.wt. 446

黃芩素Baicalein; mol. wt.270

本實驗利用液相色譜-質譜技術，采用葛根素作為內標，對黃芩藥材中黃芩苷、黃芩素進行結構鑒定和定量分析。該方法與紫外分光光度法[10]和高效液相色譜法[11-13]相比，具有靈敏、準確、快速等特點。

2 實驗材料和儀器

2.1 儀器

Agilent l290液相色譜系統(包括G4220A型二元輸液泵，G4226A型自動進樣器，Gl316C型柱溫箱)，Agilent 6460 Triple Quad LC/MS 三重四極桿串聯質譜儀，配備電噴霧電離源(ESI源)，美國Agilent公司；梅特勒XS105DU 分析天平(梅特勒-托利多國際股份有限公司)；SB3200 超聲波清洗器(上海波龍電子設備有限公司)；0.45 μm濾膜過濾器、微量注射器。

2.2 材料與試劑

黃芩藥材，批號：130401，購自上海康橋中藥飲片有限公司；黃芩苷對照品，中國藥品生物制品檢定所，批號：110715-201016，供含量測定用；黃芩素對照品，中國藥品生物制品檢定所，批號：111595-200904，供含量測定用；葛根素對照品，中國藥品生物制品檢定所，批號：0752-9605，供含量測定用；甲醇、乙腈(色譜純，Merk)，上海國藥集團化學試劑有限公司；超純水。

3 方法與結果

3.1 色譜條件及質譜條件

(1) 色譜條件。色譜柱：Eclipse XDB C18(50 mm × 2.1 mm × 1.8 μm)，C18保護柱(10 mm × 2.1 mm × 3.5 μm)；流動相：溶劑A：水(0.1%甲酸水溶液)，溶劑B：甲醇(0.1%甲酸甲醇溶液)；流速：0.4 mL/min；進樣量：2 μL。流動相梯度洗脫比例見表1。

表1 HPLC-MS/MS流動相梯度洗脫條件

(2) 質譜條件。 離子源：電噴霧離子化源(ESI)；離子源噴射電壓：+4 kV；干燥氣(N2)流速：10 L/min；干燥氣溫度：350 ℃；霧化氣(N2)壓力：275.8 kPa(40 psi)；質譜檢測器選擇性監測條件見表2，黃芩苷、黃芩素和葛根素色譜圖見圖1～3。

3.2 試樣制備

(1) 對照品貯備液。分別稱取黃芩苷、黃芩素對

表2 HPLC-MS-MS質譜檢測器監測參數

圖1 黃芩苷對照品HPLC-MS/MS色譜圖

圖2 黃芩素對照品HPLC-MS/MS色譜圖

圖3 葛根素對照品HPLC-MS/MS色譜圖

照品約5 mg，精密稱量，置25 mL容量瓶中，采用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，黃芩苷、黃芩素對照品貯備液濃度分別為187 μg/mL、25.2 μg/mL。

(2) 內標溶液。稱取葛根素對照品約5 mg，精密稱定，置50 mL量瓶，甲醇溶解并稀釋至刻度，準確吸取上述葛根素溶液適量，50 %甲醇水溶液稀釋制成濃度為10 μg/mL內標溶液。

(3) 對照品溶液的配制。準確吸取黃芩苷、黃芩素對照品貯備液適量，加50%甲醇水溶液稀釋成系列濃度對照品溶液，其中黃芩苷濃度分別為:46.75，23.38，11.69，5.85，2.925，1.462 5 μg/mL；黃芩素濃度分別為：6.3，3.15，1.575，0.787 5，0.393 8，0.196 9 μg/mL。

(4) 供試品溶液的制備。 黃芩藥材50 g粉碎，取約0.1 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，加50 %甲醇適量，超聲處理30 min，放置，冷卻至室溫，轉移至50 mL量瓶中，以50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾。

3.3 進樣分析

分別精密移取系列對照品溶液和供試品溶液各0.4 mL，加內標溶液1 mL，50 %甲醇水溶液稀釋至10 mL。各進樣2 μL，記錄總離子流色譜圖、黃芩苷、黃芩素及葛根素質譜圖和色譜圖。供試品溶液重復測定3次。

4 結果與分析

4.1 定性分析

黃芩苷(相對分子質量446.35)在正離子檢測方式下的[M+H]+峰為準分子離子峰，m/z為447.1；二級質譜特征離子的m/z為271.0，由準分子離子m/z447.2的[M+H]+失去一分子的葡萄糖醛酸產生，與對照品的質譜圖和色譜保留行為對照可確認為黃芩苷。同法確認黃芩素準分子離子m/z271.2及二級質譜離子m/z123.3，葛根素(內標)分別為m/z417.0及m/z296.9。

4.2 定量分析

(1) 分別以黃芩苷、黃芩素與內標峰面積比值和對照品濃度作線性回歸，并計算回歸方程、相關系數和線性范圍(見表3)。

表3 黃芩苷與黃芩素線性關系考察

結果表明：黃芩苷濃度在0.058 5～1.87 μg/mL范圍內，進樣量與峰面積線性關系良好，線性回歸方程為:Y=0.004 493X-0.098 62，γ=0.995 6；黃芩素濃度在0.007 88～0.252 μg/mL范圍內，進樣量與峰面積線性關系良好，線性回歸方程為:Y=0.000 899 6X+0.005 768，γ=0.999 6。

(2) 分別將黃芩苷、黃芩素與內標峰面積比值的峰面積值代入回歸方程，計算黃芩藥材中黃芩苷和黃芩素的含量(見表4)。

表4 黃芩藥材中黃芩苷和黃芩素含量測定結果

結論：黃芩藥材中黃芩苷的含量為15.81%，黃芩素的含量為1.99%。

5 結 語

近年來，隨著素質教育的提出，各高校越來越注重培養學生的實際動手能力。大型儀器設備是高等學校從事教學、科研的重要條件和基本手段，利用大型儀器設備指導學生科研不僅可以提高大型儀器設備的使用效率，同時對提高學生的科研能力也有益處[14-15]。我校分析化學實驗教學改革中，在利用大型儀器設備進行實驗教學活動中，取得了一定的經驗。在中藥學、藥學等專業本科生的實驗教學中，引入高效液相色譜、氣相色譜、紅外光譜、原子吸收光譜和高效液相色譜-質譜聯用儀等大型實驗儀器，并將科研成果引入實驗教學中，通過大型儀器實驗教學，能夠更好地激發學生的學習熱情、培養學生的創新意識并鍛煉學生動手實踐的能力，可以為學生今后從事科研工作奠定良好基礎。

本實驗項目是在前期科研課題研究的基礎上，根據分析化學課程實驗教學任務和課時的安排，進行的實驗內容的設置。一般分析化學中含量測定方法學考察內容包括：線性關系實驗、精密度實驗、穩定性實驗、重復性實驗和加樣回收實驗等，課題組在前期完成黃芩藥材中黃芩苷和黃芩素的含量測定方法研究中，進行了完整的方法學研究，表明本法穩定、可靠。本實驗因課時限制，在完成教學任務，保證教學質量的基礎上，故只選擇了方法學考察中線性關系作為實驗內容。