滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗氣孔運動與光合作用的關系

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(西北農林科技大學 動物科技學院， 陜西 楊凌 712100)

作為世界上栽培面積最大，利用率最廣的豆科“牧草之王”：紫花苜蓿，其產量和品質的提高，是牧草育種者最為關注的焦點，而其獨特高蒸騰的生物學特性，是品種產量的關鍵因素。孫東寶等[8]研究發現灌水能改變苜蓿葉片Pn的日變化格局，灌水較多的苜蓿葉片沒有出現光合“午休”現象，Pn的日變化趨勢呈現“單峰”型；羅永忠等[9]認為苜蓿葉水勢、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)均隨水分脅迫加劇而降低；干熱脅迫下苜蓿凈光合速率與蒸騰速率、氣孔導度、水分利用效率均成極顯著正相關而與胞間二氧化碳濃度成極顯著負相關[10]。佟長福[11]研究了苜蓿的葉水勢、蒸騰速率在不同灌溉水平下的日變化規律與土壤含水率和氣象因素之間關系，建立了葉水勢和蒸騰速率與氣象因素間的定量關系式。本文擬對滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗的氣孔運動與光合生理變化進行研究，旨在揭示紫花苜蓿水分脅迫與光合生理以及生長的關系，試驗結果可為深入研究紫花苜蓿抵抗滲透脅迫的機制及苜蓿高產育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫花苜蓿品種維多利亞(MedicagoSativa‘victorian’)，購自楊凌金道種子公司。

1.2 試驗方法

1.2.1幼苗培養 本試驗于2015年3月在西北農林科技大學動科學院草業科學實驗室進行。挑選整齊一致完整的紫花苜蓿種子，用5% NaClO對種子消毒，浸泡30 min同時每隔10 min攪拌一次，最后用蒸餾水沖洗3～4次洗凈，并用吸水紙吸干種子殘留水分。在121℃下對培養皿進行高壓滅菌，持續40 min。將消毒種子均勻地擺在墊有濾紙的培養皿中，每個培養皿50粒種子，于25±1℃，1 500 lx(12 h·d-1)的光培養箱中萌發。待兩片子葉完全展開時選擇健康、生長一致的幼苗進行移栽，1/4MS營養液培養。幼苗第三片真葉完全展開時對幼苗進行處理，每個處理設3個重復。處理分別是：CK(對照)：1/4MS營養液；TM(脅迫)：1/4MS營養液+15% PEG-6000。

1.2.2光合特性指標與幼苗測定 處理后第3 d、5 d、7 d，幼苗株高、根長、側根數用根系掃描儀掃描植株，再利用win RHNZOR分析軟件進行測定，每處理測定5株，取均值；凈光合速率(Pn，μmol CO2·m-2·s-1)、蒸騰速率(Tr，mmol H2O·m-2·s-1)、氣孔導度(Gs，cm氣s-1)及胞間CO2濃度(Ci，μmol·mol-1)等用CI-340型手持式輕便型光合測定系統在自然光條件下進行測定，每個處理測5株，取均值。葉片瞬時水分利用效率：WUE(μmol CO2·mmol-1)=Pn/Tr[12]， 光能利用效率：LUE(mmol CO2·mol-1) = Pn/PAR[13]。

1.2.3葉片氣孔指標測定 光合測定后，取葉片置于4%戊二醛溶液中，4℃冷藏，經過乙醇梯度脫水，丙酮置換浸透，臨界點干燥，粘臺噴金后，在JSM-6360 LI掃描電鏡下觀察葉片表皮氣孔形態特征，選取典型視野照相。統計單位視野內的氣孔數目，計算氣孔密度；測量氣孔(保衛細胞)的長度(縱軸長)和寬度(橫軸長)與開度的長度和寬度，5次重復，每片葉隨機觀察10個視野。

1.3 數據分析

試驗數據通過Excel 2007進行整理，數據表示means±SD，采用DPS軟件對平均數以Duncan’s 新復級差法進行多重比較。差異顯著記為P<0.05，差異極顯著記為P<0.01。

2 結果與分析

2.1 滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗生長變化

15% PEG滲透脅迫下，第5、7天TM株高比CK減少了10.8%和22.3%(P<0.05)，第7天CK株高比第3、5天增加了24.8%、19.5%(P<0.05)，第7天TM株高僅變化了5.3%；苜蓿幼苗根系生長也發生顯著變化，第5、7天TM根長比CK分別減少了5.7%和4.0%(P<0.05)(圖1-A,B,D,E,F)，比地上生長受抑制程度明顯要小。脅迫初期(第3、5天)對幼苗側根數影響不大，但第7天TM幼苗側根數比CK減少了34.9%(P<0.05)(圖1-C,D,E，F)；第7天CK側根數比第3天增加了152%，而TM增加了146%。滲透脅迫會抑制苜蓿幼苗側根數的增加，隨著滲透脅迫處理時間的延長，苜蓿幼苗的側根數都有所增加，但是TM側根數增加的比較少。滲透脅迫影響了苜蓿幼苗生長及根系發育，尤其地上生長顯著受抑制。

圖1 滲透脅迫對紫花苜蓿幼苗生長的影響Fig.1 Effect of osmotic stress on seedling growth of Alfalfa注：同列數據后標不同字母者差異顯著(P<0.05)(下同)Note：The different letters in the same column mean significant differences at the 0.05 level, the same as below

2.2 滲透脅迫對紫花苜蓿氣孔運動的影響

2.2.1滲透脅迫對氣孔密度和氣孔大小的影響 由圖2,3-A可知，15%PEG脅迫的第3天，TM氣孔密度與CK尚無顯著差異，處理后第5天TM與CK存在顯著差異，降低了22%(P<0.05)，第7天時則降低了55%(P<0.05)；15% PEG脅迫顯著影響苜蓿著幼苗氣孔寬度，第3，5，7天TM比CK分別減少了32%，18%，12%(P<0.05)(圖2,3-C)，但對苜蓿葉片氣孔長度影響較小，僅在第7天TM比CK降低了46.9%(P<0.05)(圖2,3-B)。這說明：15%PEG脅迫處理對紫花苜蓿葉片氣孔長度造成的影響不大，卻導致紫花苜蓿葉片的氣孔寬度及密度發生顯著變化。

圖2 滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片氣孔觀察Fig.2 Observation of stomatal movement in Alfalfa seedling leaves under osmotic stress

2.2.2滲透脅迫對紫花苜蓿氣孔開度大小的影響 由圖3D可知，15%PEG脅迫的第3天，TM和CK的氣孔開度長存在顯著差異，降低了18%(P<0.05)；脅迫時間逐漸延長，TM和CK無顯著差異(5，7天)。由圖3E可知，15%PEG脅迫的第3，5，7天，TM和CK的氣孔開度寬均存在顯著差異，分別降低了38%、82%和56%(P<0.05)，那么，當外部水分不足時，紫花苜蓿的氣孔開寬度降低，通過氣孔逐漸閉合的方式來降低蒸騰作用，從而達到生物節水的目的。

圖3 滲透脅迫下紫花苜蓿氣孔的變化Fig.3 The effect of osmotic stress on the stomatal density and stomatal size of the Alfalfa seedling

2.3 滲透脅迫對紫花苜蓿幼苗光合作用的影響

2.3.1凈光合速率變化 由圖4A可看出，15%PEG脅迫第3、5、7天，TM與CK相比，紫花苜蓿葉片凈光和速率(Pn)顯著下降(P<0.05)，分別減少了33.7%、44.9%、31.9%；第7天與第3天相比，TM和CK的凈光合速率分別增加了19.7%、16.2%。滲透脅迫顯著抑制植物的光合作用，降低其光合速率，處理的第5天植物光合下降最多，隨后植物可能經過自身的調節出現升高趨勢。

圖4 滲透脅迫對紫花苜蓿幼苗光合、蒸騰速率和水分利用率的影響Fig.4 The effect of osmotic stress on photosynthetic characteristics, transpiration and water use efficiency of Alfalfa.

由圖4B可看出，15%PEG脅迫的第3天，TM的光能利用率與CK無顯著差異，第5、7天有顯著差異(P<0.05)，第7天TM比CK減少了33.3%，TM和CK第7天的光能利用率比第3天增加了255%，445%。滲透脅迫使紫花苜蓿幼苗葉片光能利用效率顯著降低(P<0.05)。

2.3.2滲透脅迫對紫花苜蓿蒸騰的影響 由圖4C可知，15%PEG脅迫的第3，5，7天，TM的蒸騰速率(Tr) 比CK分別下降了34%，36%和37%(P<0.05)；第3天TM與CK葉片瞬時水分利用率無顯著差異，第5，7天時TM與CK存在顯著差異，分別下降了35%和30%(P<0.05)(圖4D)。隨著水分不足的加深，植物則不斷進行自我蒸騰能力的調節，來維持生命活動基本水分要求，降低水分不足對細胞和組織的傷害。

2.4 滲透脅迫下紫花苜蓿生長與光合之間的關系

相關分析表明(表1)：滲透脅迫下，紫花苜蓿葉片Tr與根長、株高、側根數呈極顯著負相關(P<0.01)；根長與Ci、株高呈顯著正相關(P<0.05)；株高與Pn呈極顯著正相關(P<0.01)，與Tr、Gs呈極顯著負相關或負相關(P<0.01或P<0.05)；側根數與Ci、株高呈極顯著正相關或顯著正相關(P<0.01或P<0.05)，與Tr呈極顯著負相關(P<0.01)。

表1 滲透脅迫下生長與光合相關系數表Table 1 The effect of osmotic stress on photosynthetic characteristics and Seedling growth of Alfalfa.

注：上標*和 ** 分別表示在0.05水平和0.01水平上的差異顯著性

Note：* and ** indicate the significant difference at the 0.05 level and 0.01 level, respectively

3 討論與結論

植物葉表皮上氣孔是植物與外界水、氣交換的主要通道，直接控制蒸騰強度。葉水勢為-4.68 MPa或Tr為3.27 g·m-2·h-1時，苜蓿氣孔開始關閉[14]，嚴重干旱時苜蓿氣孔關閉來限制水分的散失[15]，觀察了12個抗旱性不同苜蓿品種的葉表皮特征，李波等[16]認為氣孔開度和密度與苜蓿品種抗旱性強弱相關。隨著脅迫(15% PEG)強度加大，本試驗中苜蓿幼苗氣孔密度逐漸減少，氣孔的大小及開度隨脅迫時間也逐漸減小；黃瓜(Cucumissativus)[17]為了延緩干旱脅迫，其幼苗葉片氣孔密度及開度變小，大多數呈現關閉狀態，與本試驗研究結果一致，即苜蓿氣孔數目，大小和開度大小與蒸騰強度密切相關。15% PEG處理下苜蓿氣孔密度減少、氣孔開度大小的降低，減緩了蒸騰作用提高了苜蓿水分利用率，葉片凈光合速率和蒸騰速率決定著水分利用率，反映出植物對逆境適應能力的強弱，那么，干旱下氣孔密度及開度變化就可衡量苜蓿蒸騰強度及其抗旱強弱。

光合作用是植物體最重要的生理生化過程，直接關系著植物生長、產量及其抗逆性。干旱脅迫致使玉米(Zeamays)氣孔關閉引起蒸騰及光合下降，是玉米減產的主要生理機制[18]；抗旱性強的紫花苜蓿PSⅡ反應中心電子傳遞活性受到的影響小，凈光合速率下降較慢[19]，光合強弱顯著關聯著植物生長及其抗逆性。滲透脅迫最先影響植物的根系[20-21]，根系體積和根長密度會因土壤干旱而顯著增加[22]；根系吸水阻力增加引起氣孔關閉及蒸騰減少，是水分匱乏下苜蓿幼葉凈光合速率下降主要原因[23]。干旱脅迫下紫花苜蓿的主根長受到顯著抑制[3]，苜蓿根系會縱向伸長[24]，在15% PEG模擬水分脅迫下，苜蓿幼苗側根數與Ci呈極顯著正相關(r=0.820)，則干旱下苜蓿主根受抑制而側根變發達，極有可能是由氣孔關閉后CO2濃度的升高引起。作物根系茂密會消耗大量光合同化物，造成水分利用效率降低[25]，15% PEG滲透脅迫下苜蓿側根數的增加不能促進光合作用，表明干旱時側根增加只利于苜蓿抗旱卻對苜蓿產量貢獻不大；本試驗中與苜蓿產量相關的根長、株高均與蒸騰速率呈顯著負相關(r=-0.910，r=-0.980)，凈光合速率與蒸騰速率也呈顯著負相關(r=-0.690)，所以當苜蓿遭遇水分脅迫時，通過氣孔關閉或密度減少促使蒸騰下降，確保其體內有足夠的光合有效水分，以此保證水分匱乏時的光合能力，這有可能是旱作下苜蓿抗旱又增產的一個有效途徑。