潔白丸微生物限度檢查方法的探討

杜海娟，滕寶霞，牟建平

（甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730070）

潔白丸為非滅菌的口服中藥制劑，具有健脾和胃、止痛止吐、分清泌濁之功效，主治胸腹脹滿、胃脘疼痛、消化不良、嘔逆泄瀉、小便不利[1]。在按現行藥典[2]要求進行微生物限度檢查過程中，發現潔白丸對微生物有抑制作用，本文探討潔白丸微生物限度檢查方法，具體如下。

1 實驗材料

1.1 潔白丸

金訶藏藥股份有限公司生產，批準文號：國藥準字Z63020077，規格：0.8 g/丸。

1.2 菌種

大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）44104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003）]、乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50 094]、白色念珠菌[CMCC（F）98 001]和黑曲霉[CMCC（F）98 003]，購于中國食品藥品檢定研究院。

1.3 培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養基（TSB）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）、沙氏葡萄糖液體培養基（SDB）、麥康凱液體培養基、麥康凱瓊脂平板、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、腸道菌增菌液體培養基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基、溴化十六烷三甲胺瓊脂培養基、伊紅美蘭瓊脂培養基、RV沙門增菌液體培養基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基，均購于青島海博生物科技有限公司。

1.4 儀器與設備

超凈工作臺、生物安全柜、生化培養箱、恒溫水浴鍋、電冰箱、顯微鏡、電熱恒溫干燥箱、壓力消毒器、天平。

2 實驗方法

2.1 菌種培養及稀釋[2]

實驗所用菌種為第3代，菌懸液為第4代。

2.2 回收率計算

回收率=（實驗組菌數-供試品本底菌數）÷陽性菌數×100%。

2.3 供試液制備

取潔白丸10 g加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml，溶解、混勻，制成1∶10供試液。

2.4 需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數方法

2.4.1 常規法（1）實驗組。取潔白丸1∶10供試液，分別加入5種實驗菌株（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉）的菌懸液，制成每毫升潔白丸1∶10供試液含菌數小于100 cfu，取含菌的樣品溶液1 ml，每個菌液注2個平皿，注入所需培養基，培養、計數。（2）菌液對照組。分別取5種實驗菌的菌懸液（50～100 cfu）1 ml注皿，加培養基，培養、計數。（3）供試品對照組。用供試品替代實驗組液體注皿，實驗。（4）陰性對照組。用同批配制、滅菌的胰酪大豆胨液體培養基1 ml替代樣品注皿，注入培養基，培養、計數。具體結果見表1。

結果顯示，采用1∶10供試液1 ml注皿，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌回收率小于50%。

表1 潔白丸計數方法適用性實驗（平皿法）

2.4.2 培養基稀釋法（1）實驗組。取潔白丸1∶10供試液，分別加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的菌懸液，制成每毫升潔白丸1∶10供試液含菌數小于100 cfu，取含菌的樣品溶液0.5 ml、0.2 ml，置無菌平皿中，每個菌液每個取樣體積注兩個平皿，注入培養基，培養、計數。（2）菌液對照組、供試品對照組、陰性對照組的實驗方法同常規法。具體見表2。

表2 潔白丸計數方法適用性實驗（培養基稀釋法）

結果顯示，采用1∶10供試液0.2 ml注皿，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率大于50%，白色念珠菌回收率小于50%。

2.4.3 供試液稀釋法（1）實驗組。取潔白丸1∶10供試液，10倍稀釋制成1∶100供試液，加入白色念珠菌菌懸液，制成每毫升潔白丸1∶100供試液含菌數小于100 cfu，取含菌的樣品溶液1 ml，置無菌平皿中，每個菌液注2個平皿，注入培養基，培養、計數。（2）菌液對照組、供試品對照組、陰性對照組的實驗方法同常規法。具體見表3。

結果顯示，采用1∶100供試液1 ml注皿，白色念珠菌回收率高于50%。

2.4.4 計數檢查方法的確認 需氧菌、霉菌和酵母菌總數計數采用1 ml（1∶100）注皿方法，加入5種陽性菌的回收率均在50%～200%之間，檢查方法滿足《中國藥典》2015年版四部微生物限度方法適用性要求，檢查方法可行，結果見表4。

表3 潔白丸計數方法適用性實驗（供試液稀釋法）

表4 潔白丸計數方法適用性確認實驗

2.5 控制菌方法適用性實驗

2.5.1 大腸埃希菌 采用《中國藥典》2015年版四部148頁大腸埃希菌常規方法[2]進行實驗，可以檢出陽性菌（大腸埃希菌），見表5。

2.5.2 耐膽鹽革蘭陰性菌 采用《中國藥典》2015年版四部147頁耐膽鹽革蘭陰性菌常規方法[2]進行實驗，可以檢出陽性菌（大腸埃希菌和銅綠假單胞菌），見表6。

表5 大腸埃希菌方法適用性確認實驗

表6 耐膽鹽革蘭陰性菌方法適用性實驗

2.5.3沙門菌 采用《中國藥典》2015年版四部147頁沙門菌常規方法[2]進行實驗，可以檢出陽性菌（沙門菌），見表7。

3 討論

（1）采用1∶100供試溶1 ml注皿，需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數回收率均大于50%，按《中國藥典》2015年版四部1105、1106微生物計數法檢查，方法可行。

（2）控制菌（大腸埃希菌、沙門菌、耐膽鹽革蘭陰性菌）按《中國藥典》2015年版四部1106、1107控制菌檢查法進行實驗，能檢出陽性菌，方法可行。

（3）實驗結果顯示，金訶藏藥股份有限公司生產的潔白丸對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的生長有抑制作用。潔白丸是由訶子（煨）、南寒水石、翼首草、五靈脂膏、土木香、石榴子、木瓜、沉香、丁香、石灰華、紅花、肉豆蔻、草豆蔻、草果仁14味中藥制成[3]，其中訶子具有較強的抑菌作用[4]，沉香能抑制金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的生長[5]。

表7 沙門菌方法適用性實驗

[1]陳來.藏藥潔白丸簡介[J].河南中醫，2012（10）：1371.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（四部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[3]包桂芬.藏藥“潔白丸”主要藥物分析[J].甘肅中醫學院學報，1996（4）：

49-50.

[4]孟祥鋒，劉春月.訶子等中草藥源農藥對常見植物病原菌的抗菌活性研究[J].現代農業科技，2008（19）：149-150.

[5]廖建良，吳國祥.沉香提取物的抑菌活性[J].江蘇農業科學，2013（6）：285-287.