根皮苷可增強索拉非尼抑制肝癌細胞能量代謝及活力

王德華， 劉云燕， 李敏然， 苗同國， 任桂芳， 董金紅

河北省石家莊市第五醫(yī)院介入腫瘤科，石家莊 050017

肝細胞肝癌(簡稱肝癌)作為一種高危惡性腫瘤，全球發(fā)病率占惡性腫瘤發(fā)病率的第6位，致死率占惡性腫瘤致死率的第3位[1]。由于肝癌早期癥狀不明顯，且進展迅速，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已屬晚期，而此時鮮有有效治療手段。近年來，索拉非尼在晚期肝癌患者的治療中發(fā)揮了重要作用。索拉非尼作為一種多靶向激酶抑制劑，是目前唯一被批準用于經皮肝動脈化療栓塞(TACE)失敗后或極末期肝癌治療的藥物[2]。然而，研究[3]顯示，索拉非尼對晚期肝癌患者的有效率僅30%，且患者常在用藥6個月內產生耐受。因此，尋找有效增強索拉非尼抗腫瘤效應的方法并探索其機制顯得急迫而重要。

腫瘤細胞的Warburg效應使其呈現(xiàn)不同于正常細胞依賴葡萄糖酵解供能的代謝模式[4-5]，糖酵解產生的能量被用于腫瘤的快速擴增與遷移。腫瘤細胞與正常細胞代謝模式的差異有望成為調控腫瘤生長的靶點。而葡萄糖通過葡萄糖轉運體進入正常或腫瘤細胞是糖酵解的第1步。根皮苷是一種葡萄糖轉運抑制劑，本研究探討了其對索拉非尼抗腫瘤效應的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 人HepG2細胞購自上海細胞生物研究所；血清、培養(yǎng)基購自Abcam公司；索拉非尼由德國拜耳公司生產；根皮苷購自上海生命科學院。用CCK-8法確定50%細胞生長抑制(IC50)所須索拉非尼和根皮苷濃度，分別為5.01 μmol/L、4.98 μmol/L，均采用5 μmol/L。

1.2 細胞活力檢測 采用CCK-8法檢測細胞活力。索拉非尼組HepG2細胞給予索拉非尼5 μmol/L處理48 h；根皮苷組HepG2細胞給予根皮苷5 μmol/L處理48 h；索拉非尼聯(lián)合根皮苷組(聯(lián)合組)給予索拉非尼5 μmol/L+根皮苷5 μmol/L處理48 h。通過測定D450處光密度值，評估各組細胞活力。

1.3 細胞葡萄糖攝取 通過葡萄糖代謝比色試劑盒(Biovision公司)檢測HepG2細胞葡萄糖攝取情況。各組HepG2細胞藥物處理48 h后，按照試劑盒說明書順次加入KRPH、葡萄糖攝取緩沖液、2DG，室溫避光孵育30 min后檢測熒光值。

1.4 細胞ATP檢測 采用ATP Detection Assay Kit(Abcam 公司)檢測細胞ATP。各組HepG2細胞藥物處理48 h后，按照說明書制作標準曲線，順次加入ATP工作液。用分光光度計通過檢測光信號強弱，以此反映細胞內ATP水平。

1.5 細胞caspase-3活力與凋亡細胞計數(shù)檢測 采用 caspase-3 assay kit試劑盒(Abcam 公司)，通過比色法測定細胞caspase-3活力。凋亡細胞計數(shù)通過Annexin Ⅴ/PI雙染色后，應用流式細胞儀進行定量計數(shù)。

2 結 果

2.1 索拉非尼和根皮苷對細胞活力的影響 CCK-8檢測結果(圖1)顯示：索拉非尼5 μmol/L處理48 h后，HepG2細胞活力降低(P<0.05)；根皮苷5 μmol/L處理48 h后，HepG2細胞活力降低，但差異無統(tǒng)計學意義；聯(lián)合組細胞活力進一步降低，與其他組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 索拉非尼和根皮苷對葡萄糖攝取的影響 細胞葡萄糖攝取實驗結果(圖2)顯示：索拉非尼5 μmol/L處理48 h后，HepG2細胞葡萄糖攝取減少，但差異無統(tǒng)計學意義；根皮苷5 μmol/L處理48 h后，HepG2細胞葡萄糖攝取較對照組與較索拉非尼組均減少(P<0.05)；聯(lián)合組細胞葡萄糖攝取進一步減少，與其他組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 各組HepG2細胞活力檢測結果

*P<0.05與對照組相比；△P<0.05與索拉非尼組相比；▲P<0.05與根皮苷組相比

圖2 各組HepG2細胞葡萄糖攝取檢測結果

*P<0.05與對照組相比；△P<0.05與索拉非尼組相比；▲P<0.05與根皮苷組相比

2.3 索拉非尼和根皮苷對細胞內ATP含量的影響 細胞ATP檢測結果(圖3)顯示：與對照組相比，索拉非尼5 μmol/L與根皮苷5 μmol/L處理48 h后，HepG2細胞內ATP生成均減少(P<0.05)；聯(lián)合組細胞內ATP進一步減少，與其他組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 各組HepG2細胞ATP含量測定結果

*P<0.05與對照組相比；△P<0.05與索拉非尼組相比；▲P<0.05與根皮苷組相比

2.4 索拉非尼和根皮苷對細胞凋亡的影響 Caspase-3活力檢測結果(圖4)顯示：與對照組相比，索拉非尼5 μmol/L與根皮苷5 μmol/L處理48 h后，HepG2細胞內caspase-3活力均提高(P<0.05)；聯(lián)合組caspase-3活力進一步提高，與其他組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組HepG2細胞凋亡與caspase-3變化情況一致(圖5)。

圖4 各組HepG2細胞caspase-3 活力檢測結果

*P<0.05與對照組相比；△P<0.05與索拉非尼組相比；▲P<0.05與根皮苷組相比

圖5 各組HepG2細胞凋亡檢測結果

*P<0.05與對照組相比；△P<0.05與索拉非尼組相比；▲P<0.05與根皮苷組相比

3 討 論

索拉非尼主要通過抑制Raf激酶活性和血管內皮生長因子受體、血小板衍生生長因子受體、c-kit活性等，進而抑制腫瘤細胞增殖及新生血管生成[6]。通過該作用，索拉非尼可以延長晚期肝癌患者生存時間，但有效率較低。因此，迫切須要探索可能的調控靶分子，并與索拉非尼聯(lián)合應用，進而提高索拉非尼的療效。

根皮苷可抑制多種葡萄糖轉運體或通道[7]，從而減少細胞內葡萄糖含量，抑制糖酵解，進而降低腫瘤細胞能量供給。本研究中，索拉非尼組與根皮苷組腫瘤細胞內ATP含量均減少，與研究[8]結論一致；根皮苷組細胞葡萄糖攝取減少，根皮苷引起肝癌細胞內ATP含量降低可能與其抑制葡萄糖攝取有關；索拉非尼聯(lián)合根皮苷組腫瘤細胞葡萄糖攝取和細胞內ATP含量較單藥組進一步減少，這種腫瘤細胞能量代謝抑制效應可能體現(xiàn)為細胞活力降低、凋亡增加。

本研究中，根皮苷組細胞活力與對照組差異無統(tǒng)計學意義。陳娟等[9]研究發(fā)現(xiàn)，低血糖能改善氧化損傷細胞的活力，維持細胞形態(tài)。根皮苷減少葡萄糖轉運而可能不抑制細胞的活力的具體機制仍有待進一步研究。本研究中，索拉非尼可以促進腫瘤細胞凋亡，與文獻[10]報道相似；索拉非尼聯(lián)合應用葡萄糖轉運抑制劑時，這種促凋亡效應進一步加強。這是因為索拉非尼可以降低腫瘤細胞內ATP含量，從而影響腫瘤細胞的能量代謝，而與葡萄糖轉運抑制劑聯(lián)合應用時，葡萄糖轉運被抑制。此外，葡萄糖轉運體在肝癌細胞中高表達，并與肝癌分期晚、分化差等因素相關[11-12]，而索拉非尼可通過降低缺氧誘導因子-1(HIF-1)來下調葡萄糖轉運體的表達[13-14]。因此，聯(lián)合應用葡萄糖轉運抑制劑時，索拉非尼療效增強，腫瘤細胞內能量進一步減少、細胞凋亡增加。

綜上所述，代謝抑制劑可以通過協(xié)同索拉非尼抑制腫瘤細胞葡萄糖攝取來減少細胞內能量，進而降低細胞活力、促進細胞凋亡，提高索拉非尼的療效。本研究為晚期肝細胞癌患者索拉非尼的優(yōu)化治療，以及提高晚期肝癌患者生存率提供了新思路。