PC4基因RNAi慢病毒載體的構建及有效靶序列鑒定

張真中， 楊春杰， 錢三立， 李冰玉， 鄒云增

復旦大學附屬中山醫院上海市心血管病研究所，上海 200032

以往認為，哺乳動物的心肌細胞是終末分化細胞，不可再生。然而，近年來一系列研究表明，哺乳動物的少量心肌細胞能夠再生。根據大氣層中(14C)的變化，推測成人心肌細胞的年再生速率約為1%[1]；出生7 d內的小鼠心臟在損傷后可以再生[2-4]。在動物中發現的再生心肌細胞由心肌細胞增殖而來，而非干細胞或者心肌祖細胞的分化形成[5]。然而，成熟心肌細胞再生的分子調控機制目前還不清楚。

本課題組前期研究發現，在通過二甲基亞砜(DMSO)定向誘導P19CL6細胞分化為心肌細胞的過程中，PC4發揮重要作用[6]。PC4是一個高豐度核蛋白，在基因轉錄、復制、修復和細胞轉化過程中扮演重要角色。研究[7-8]報道，PC4為轉錄共激活因子，為成肌細胞分化所必需[7-8]。本研究采用慢病毒載體介導的RNA干擾技術降低大鼠心房肌細胞H9C2中PC4基因的表達，篩選出了有效的PC4 RNA干擾序列，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株的來源及培養 H9C2和HEK-293T細胞株購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，由上海心血管疾病研究所液氮保種。H9C2細胞采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基培養；HEK-293T細胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養。DMEM/F12培養基(11320-033)和DMEM培養基(11965-084)以及胎牛血清(10099-141)均購自Gibco公司。

1.2 候選干擾靶序列的設計及合成 通過Bioinformatics & Research Computing數據庫(http://sirna.wi.mit.edu/)篩選3條潛在的PC4干擾靶序列，分別為shPC4-1、shPC4-2和shPC4-3，具體位置見圖1。干擾靶序列(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

圖1 PC4干擾靶序列設計示意圖

名稱 序列shPC4-1F5'-CTA GCA GAG ATG ATA ACA TGT TCC AGA CTC GAG TCT GGA ACA TGT TAT CAT CTC TGT TTT TG-3'shPC4-1R5'-AAT TCA AAA ACA GAG ATG ATA ACA TGT TCC AGA CTC GAG TCT GGA ACA TGT TAT CAT CTC TG-3'shPC4-2F5'-CCG GGG GCA TAT CAA GTC CAT TAT TCT CGA GTA ATG GAC TTG ATA TGC CCT TTT TTT G-3'shPC4-2R5'-AAT TCA AAA AGG GCA TAT CAA GTC CAT TAT TCT CGA GTA ATG GAC TTG ATA TGC CCT T-3'shPC4-3F5'-CTA GCC CAG ACT ACA TGG AGT CAA ATC TCG AGA TTT GAC TCC ATG TAG TCT GGG TTT TTG-3'shPC4-3R5'-AAT TCA AAA ACC CAG ACT ACA TGG AGT CAA ATC TCG AGA TTT GAC TCC ATG TAG TCT GGG-3'

1.3 慢病毒載體的構建、鑒定及轉染效率的測定 使用二代慢病毒包裝系統包裝PC4慢病毒shPC4，所用的載體均來源于Addgene數據庫，分別為干擾載體pLKO.1 puro、干擾對照載體pLKO.1 puro GFP、包裝載體psPAX2和pMD2.G。使用AgeⅠ(R0552)和EcoRⅠ(R0101)內切酶(NEB公司)將pLKO.1 puro載體的多克隆位點進行雙酶切，將干擾靶序列克隆到pLKO.1 puro載體上，PCR鑒定結果。

將重組的PC4-pLKO.1 puro，以及包裝質粒和包膜質粒PC4-psPAX2、PC4-pMD2.G共同轉染入HEK-293T細胞中，包裝成慢病毒shPC4；對照組用pLKO.1 puro GFP代替PC4-pLKO.1 puro。H9C2心肌細胞培養48 h后轉染慢病毒，繼續培養48 h后熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

1.4 不同靶序列干擾效果的對比

1.4.1 qRT-PCR檢測PC4基因表達 取慢病毒感染3 d的H9C2心肌細胞，采用天根生化科技(北京)有限公司培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒[DP430，天根生化科技(北京)有限公司]提取細胞RNA，經反轉錄后使用SYBR Premix EX Taq試劑盒(RR820A，TaKaRa公司)進行熒光實時定量PCR，引物信息見表2。

表2 qRT-PCR引物信息

1.4.2 Western印跡法檢測PC4蛋白表達 取慢病毒感染4 d的H9C2心肌細胞，采用RIPA裂解液(P0013C，碧云天公司)提取慢病毒感染4 d的H9C2心肌細胞的總蛋白；用Pierce BCA Protein Assay Kit(23225，Thermo公司)測定總蛋白濃度。用Western印跡檢測PC4的表達(將GAPDH作為對照)。PC4抗體(11956-1-AP)購自Proteintech公司，GAPDH(ab9485)購自Abcam公司。

2 結 果

2.1 慢病毒載體的構建、鑒定及包裝 PC4與pLKO.1 puro、psPAX2、pMD2.G、pLKO.1 puro GFP重組質粒經酶切、測序顯示，構建成功(圖2)。pLKO.1 puro GFP、psPAX2、pMD2.G重組質粒經HEK-293T細胞包裝24 h后，發熒光的細胞比例占90%，提示包裝成功(圖3A)。

圖2 shPC4慢病毒載體構建后酶切鑒定圖

1. Marker； 2： shPC4-1質粒酶切片段； 3： shPC4-2質粒酶切片段； 4： shPC4-3質粒酶切片段； 5： pLKO質粒

2.2 shPC4慢病毒干擾效果 H9C2心肌細胞轉染慢病毒shPC4，同時使用pLKO.1 puro GFP慢病毒作為陰性對照。pLKO.1 puro GFP慢病毒感染心肌細胞72 h后，綠色熒光的細胞占85%以上(圖3B)，說明包裝出來的慢病毒能夠有效感染心肌細胞。

圖3 熒光顯微鏡下慢病毒載體的包裝及轉染細胞表現

A:HEK-293T細胞轉染重組質粒24后；B:H9C2心肌細胞轉染慢病毒后. Original magnification： ×200

2.3 不同靶序列shPC4慢病毒干擾效果對比 將慢病毒感染3、4 d的心肌細胞提取RNA和蛋白，從轉錄水平和蛋白水平分別檢測3條候選靶序列對心肌細胞的PC4基因干擾效率。qRT-PCR結果表明：shPC4-1可使心肌細胞中PC4基因的表達水平下降60%，其抑制效率最高(P<0.05，圖4A)；蛋白免疫印跡表明：shPC4-1慢病毒質粒轉染后抑制效率最高(P<0.05，圖4B)。

圖4 慢病毒轉染心肌細胞后PC4基因(A)及蛋白(B)的表達

3 討 論

PC4蛋白是只有127個氨基酸組成的細胞核冗余蛋白，首先在HeLa細胞系的核提取物中被發現。體外發現其N端具有增強轉錄的活性；C端能分別結合單鏈DNA和雙鏈DNA，特別是對沒有配對的DNA具有強親和力[9]。此外，PC4能夠與多個轉錄因子直接相互作用，從而增強其活性，如VP16、GAL4、AP2、SP1、TAT、TFIIB、p53等[9-11]。PC4與不同的轉錄因子作用位點不同。其能夠結合在VP16、GAL4、AP2的活性區，TAT的RNA結合區，SP1和p53的DNA結合區，p53的C端調控區。這表明PC4在介導不同轉錄因子時作用機制不同。

PC4蛋白存在翻譯后修飾，主要包括磷酸化修飾和乙?；揎?。研究[12]發現，酪蛋白激酶2 (casein kinase Ⅱ，CKⅡ)可磷酸化PC4；PC4 的N端有一段富含絲氨酸的氨基酸序列(3～22)，CKⅡ能同時磷酸化該區域的7～8個絲氨酸，從而抑制PC4的共激活功能。研究[13]發現，PC4能夠被另一個轉錄共激活子p300乙?；?，從而促進PC4結合雙鏈DNA的能力。此外，PC4磷酸化能抑制PC4乙?；?，而PC4乙?；瘜ζ淞姿峄瘺]有影響[13]。

在世界范圍內，心血管疾病正逐漸成為發病率和致死率的首要原因。哺乳動物心臟損傷后不能再生可能是心血管疾病患者死亡率高的原因。本研究首次報道用慢病毒載體系統介導的RNA干擾技術建立心肌細胞PC4敲除模型。慢病毒載體系統介導的RNA干擾技術可以作為一種快速、有效降低目的基因表達的研究手段。本研究成功構建了PC4 RNA干擾慢病毒表達載體PC4-pLKO.1 puro，經HEK-293T細胞包裝后轉染心肌細胞，感染效率達85%。qRT-PCR和Western印跡檢測顯示，3對干擾靶序列能不同程度降低PC4基因的表達量，第1對靶序列的干擾作用最明顯。本結果為后期進一步研究PC4基因在心臟中的作用機制奠定了基礎。