黃河源區黑土灘人工草地地表結皮與未結皮區土壤微生物多樣性

李發祥， 張 濤， 羅玉珠， 張 蕊， 韓 瑾， 白彥福， 董全民， 周華坤， 尚占環

(1. 青海三江源生態保護和建設辦公室，青海 西寧，810008； 2. 蘭州大學生命科學院，草地農業生態系統國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730000； 3. 青海省果洛州畜牧獸醫工作站，青海 果洛 814000； 4. 中國科學院西北生態環境資源研究院，甘肅 蘭州 730020； 5. 青海大學畜牧獸醫科學院，青海 西寧 81000；6. 中國科學院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008)

“黑土灘”是指在青藏高原上，海拔3 500～4 500 m之間的高寒草甸極度退化后形成的暖季生長大量毒草，冷季黑土裸露的草地，是一種外觀描述性的叫法，無生物學上的意義[1-2]。“黑土灘”是由氣候變化、過度放牧和鼠害等因子共同作用的結果[3]。“黑土灘”是高寒草甸的一種特殊類型的荒漠化，“黑土灘”的出現說明天然草地已經發生了嚴重的退化。我國大約有703萬公頃的“黑土灘”，主要分布在西藏和青海，三江源地區“黑土灘”草地面積約為184萬公頃。三江源區“黑土灘”的出現嚴重影響該區域高寒草地生態功能和生產功能的正常發揮[4]，已成為制約當地經濟發展和生態環境保護的瓶頸。如何遏制草地退化、進行草地植被恢復是當前青藏高原地區社會、經濟和環境可持續發展面臨的重大難題[5]。其中建植人工草地是“黑土灘”治理的首選方法，其在“黑土灘”草地生產性能和生態功能方面均有重要的意義。但建植人工草地也有其缺點，建植的人工草地往往在3～5年后再次出現退化。因此，建植人工草地恢復“黑土灘”退化草地是否合理是不確定的， “黑土灘”治理的工作仍面臨困境。

土壤生物結皮在草地退化和恢復機制的研究中扮演著重要的角色[7]。土壤生物結皮(biological soil crusts, BSCs)是指隱花植物與土壤中的細菌、真菌及土壤中的顆粒物組合形成的生物覆蓋體。土壤生物結皮對外界脅迫具有一定的抵抗性，能適應多種氣候條件和土壤生境，在全世界均有分布。土壤結皮中的生物群落主要有自養生物體和異養生物體組成。自養生物群落的光合作用是結皮群落生產力的主要來源，異養生物在結皮群落中主要起代謝和分解的作用[8]。土壤生物結皮與土壤的穩定性，水文條件和物質循環均息息相關。微生物是土壤生物結皮的主要生物組分，其多樣性和群落結構是認識微生物驅動土壤生物結皮的形成和發展的重要基礎[9]。生物結皮往往出現在高等植物生長受限的環境中，生物種類不易辨別，長期得不到科學家的關注[7]。

草地退化包括地上部分植被的退化，也包括地下部分土壤的退化。土壤微生物在土壤環境中占據重要的位置，是土壤中物質循環和能量流動的主要驅動力。土壤微生物的生物量和群落結構多樣性與植被退化和土壤理化性質的改變息息相關[10]。有研究表明，植被恢復抑制土壤生物結皮的發生，相反，土壤生物結皮也會影響植被的生長[11]。然而，在人工草地中關于土壤生物結皮的研究少見，本研究旨在揭示退化人工草地土壤結皮與否和土壤微生物中細菌群落結構多樣性之間的關系，為“黑土灘”退化草地的恢復與治理提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 研究區域自然概況

青海省果洛藏族自治州地處青藏高原腹地，位于巴顏喀拉山和阿尼瑪卿山之間、三江源區東部，地理位置北緯32°21′～35°45′，東經96°56′～101°45′之間。平均海拔4 200 m以上，年均氣溫-4℃，年均降水量400～700 mm，屬高寒氣候[12]。本試驗開展于果洛州瑪沁縣、達日縣和甘德縣。該地區植被類型豐富多樣，主要有高寒嵩草草甸、高寒沼澤草甸和灌叢、疏林類植被。主要植物有小嵩草(Kobresiaparva)、矮嵩草(K.humilis)、線葉嵩草(K.capillifolia)、藏嵩草(K.tibetica)、青藏苔草(Carexmoorcroftii)、發草(Deschampsiacaespitosa)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)、小花剪股穎(Agrostismicrantha)、細葉亞菊(Ajaniatenuifolia)、美麗風毛菊(Saussureapulchra)等，土壤類型主要為高山草甸土、高山灌叢草甸土、沼澤草甸土等。

1.2 取樣方法

本試驗以果洛州瑪沁縣(13齡)、達日縣(9齡)和甘德縣(8齡)的已結皮的退化人工草地為研究對象。選取的樣地均是已退化的用散播法建植的人工草地。本試驗于2015年06月在黃河源區的果洛州進行。在上述三個研究地點，分別在有土壤生物結皮的區域和無土壤生物結皮的區域分別隨機選取三個取樣點作為重復，編號為M46、M47、M48；M70、M71、M72；M85、M86、M87；M49、M50、M51；M73、M74、M75；M88、M89、M90裝袋，分別把作為重復的三個樣本混合均勻，編號M46_48、M49_51、M70_72、M73_75、M85_87和M88_90，密封后使用干冰運至基因科技服務公司進行檢測。

表1 研究地點及樣地概況Table 1 Basic information of research plots

1.3 DNA提取與PCR擴增

根據(Geneclean II kit;BIO101,Vista,CA)試劑盒附帶的操作指南，稱取0.5 g新鮮土壤提取總DNA。用Nanophotometer分光光度計檢測DNA吸光值，范圍在1.8～2.0為合格樣品，隨即用1%的瓊脂糖電泳檢測DNA是否含有雜質，檢測合格的樣品用于構建文庫。取10ngDNA模板，選擇V3區引物338F-533R，V6區引物967F-1046R，對目的區域進行擴增。先用Qubit 2.0進行初步定量，稀釋至1 ng·ul-1，隨后用Agilent 2100對文庫的insert size進行檢測，符合預期后使用Bio-RAD CFX 96熒光定量PCR儀，使用(iQ SYBR Gree Supermix; Bio-RAD)試劑盒進行QPCR，準確定量文庫的有效濃度，合格樣品進行Hiseq測序。

1.4 數據分析

所得原始下機數據去除低質量堿基、Ns、接頭污染序列等過程完成數據過濾得到Clean Reads。將雙端測序的相應的Read1與Read2(Read1與Read2是指分別從5＇和3＇端兩個方向測序所得到的序列片段)利用序列拼接方法PEAR進行拼接，后續有效序列主要在用QIIME 1.8.0軟件中進行分析。提取分類操作單元OTUs，默認相似度大于97%的Reads為1類OTUs，默認每類OTUs具有相同的物種來源。由于存在同一物種具有多個不同OTUs的情況，在了解每個OTUs對應的物種后，把具有相同物種分類的OTUs合并到一起，統計不同樣品間物種成分的變化，即可了解不同樣品中的物種分布。表處理使用Excel 2007，生物統計學分析使用Rversion 2.15.2，文庫多樣性分析采用PAST軟件。

2 研究結果

2.1 測序樣本的質量檢測

本次試驗測序的序列數為(表2)M46_48，14202；M49_51，19062；M70_72，24513；M73_75，18896；M85_87，8934；M88_90，10551。共得到可操作分類單元(OTU)數量為M46_48，1 436個；M49_51，1 662個；M70_72，1 439個；M73_75，1 533個；M85_87，2 174個；M88_90，1 345個。經過抽平分析，16s rDNA測序分析得到1 448±137個OTU，其中M85_87得到的最少，為1 274個；M49_51得到的最多，為1 662個。生物結皮土壤的OTU數為M46_48，1 436個；M70_72，1 439個；M85_87，1 274個。相對應的未結皮土壤的OTU數為M49_51，1 662個；M73_75，1 533個；M88_90，1 345個。生物結皮土壤微生物OTU數量均低于未結皮土壤。ace和chao算法估算的OTU也是類似的規律。shannon指數也是表現出生物結皮土壤微生物低于未結皮土壤的規律。這可能是在結皮層各類養分含量豐富，增加微生物中群內的競爭，部分群落大量繁殖導致的結果。

如圖1所示在DNA測序深度達到5 000條序列時，曲線已趨于平坦。說明測序需最小滿足該測序水平才能反映樣本中絕大多數的微生物信息。表2中測序數據是經抽平分析得到的數據，其中所測片段數已遠超過5 000條，說明本次檢測測序深度合理，所測數據能反映樣本中微生物的多樣性水平。

表2 樣本的多樣性指數Table 2 Diversity index of samples

圖1 樣品Shannon-Wiener 曲線圖Fig.1 The Shannon-wiener curve of samples

2.2 門水平群落結構分析

在細菌群落門水平上(圖2)，每個樣品都包括變形菌門Proteobacteria、酸桿菌門Acidobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、放線菌門Actinobacteria、浮霉菌門Planctomycetes、藍藻Cyanobacteria、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、綠彎菌門Chloroflexi、裝甲菌門Armatimonadetes、疣微菌門Verrucomicrobia、硝化螺旋菌門Nitrospirae11個門類。其中變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、浮霉菌門、放線菌門為本試驗中土壤微生物的優勢菌群。相對豐度分別占6塊樣地的比例分別為M46-48(結皮)，77.43%；M49-51(未結皮)82.77%；M70-72(結皮)，83.36%；M73-75(未結皮)，78.54%；M85-87(結皮)，74.89%；M88-90(未結皮)，83.49%。變形菌門Proteobacteria群落細菌在結皮層含量高于未結皮地含量，放線菌門和酸桿菌門兩個門類為未結皮樣地含量高于結皮層含量，但在統計學上均未達到顯著水平。根據圖2中基于16s rDNA分析顯示的6個樣本的樹狀關系可以看出，6個樣本雖都聚為1類，但樣本間的距離有明顯的特征：有生物結皮的M70-72、M46-48和M85-87之間的距離較近，無土壤生物結皮的M73-75、M49-51和M88-90之間的距離較近。說明有土壤生物結皮樣地的土壤微生物群落結構和無土壤生物結皮樣地的差異較大，而在同一采樣地點則差異較小。

如圖3所示，將3個樣地中發生土壤生物結皮的樣地當作1個重復，未發生土壤生物結皮的樣地也作為1個重復。對有生物土壤結皮的3個樣地的微生物和未結皮樣地土壤的3個樣地微生物豐度進行T檢驗分析可知，有生物結皮和無生物結皮樣地的土壤微生物百分含量在門水平差異均未達到顯著水平，這可能是因為與是否發生土壤結皮相比，不同生境對土壤微生物細菌的影響更明顯。

圖2 門水平土壤細菌群落組成百分數Fig.2 Percentage of bacterial community composition at the phylum level

圖3 門水平土壤細菌群落相對豐度Fig.3 The relative abundance of bacterial communities at the phylum level

2.3 屬水平群落結構分析

微生物在屬水平上較為豐富(圖4)，6個樣本中均有(48%～59%)的未知序列，已知署名的共有的就有28種，分別是：WD2101_soil_group_norank、玫瑰彎菌屬(Roseiflexus)、黃質菌屬(Flavobacterium)、屈撓桿菌屬(Flexibacter)、大理石雕菌屬(Marmoricola)、薄層菌屬(Hymenobacter)、SC-I-84_norank、嗜鹽海洋粘細菌(Haliangium)、Bryobacter、480-2_norank、Caenimonas、TRA3-20_norank、Armatimonadetes_norank、Flavisolibacter、Opitutus、43F-1404R_norank、微鞘藻屬(Microcoleus)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、水庫桿菌屬(Piscinibacter)、牙球菌屬(Blastocatella)、Ferruginibacter、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、Chloroplast_norank、uncultured_norank、Subgroup_7_norank、馬賽菌屬(Massilia)、RB41_norank、Subgroup_6_norank。相對含量大于1%的序列作為代表序列，在樣地M49-51中有13種，分別是，WD2101_soil_group_norank、玫瑰彎菌屬、Caenimonas、Armatimonadetes_norank、43F-1404R_norank、微鞘藻屬、水庫桿菌屬、牙球菌屬、uncultured_norank、Subgroup_7_norank、馬賽菌屬、RB41_norank、Subgroup_6_norank；樣地M49-51中有13種，分別是，WD2101_soil_group_norank、Bryobacter、TRA3-20_norank、Armatimonadetes_norank、Flavisolibacter、43F-1404R_norank、微鞘藻屬、牙球菌屬、Ferruginibacter、芽單胞菌屬、uncultured_norank、Subgroup_7_norank、RB41_norank、Subgroup_6_norank；樣地M70-72中有20種，分別是，WD2101_soil_group_norank、黃質菌屬、薄層菌屬、480-2_norank、Caenimonas、Armatimonadetes_norank、Flavisolibacter、Opitutus、43F-1404R_norank、鞘脂單胞菌屬、水庫桿菌屬、Ferruginibacter、芽單胞菌屬、Chloroplastnorank、uncultured_norank、Subgroup_7_norank、RB41_norank、Subgroup_6_norank；樣地M73-75中有15種，分別是，WD2101_soil_group_norank、SC-I-84_norank、Caenimonas、Armatimonadetes_norank、Flavisolibacter、微鞘藻屬、水庫桿菌屬、牙球菌屬、Ferruginibacter、芽單胞菌屬、Chloroplast_norank、uncultured_norank、Subgroup_7_norank、馬賽菌屬、RB41_norank、Subgroup_6_norank；樣地M85-8中有11種，分別是，WD2101_soil_group_norank、SC-I-84_norank、TRA3-20_norank、Opitutus、鞘脂單胞菌屬、水庫桿菌屬、Ferruginibacter、芽單胞菌屬、Uncultured_norank、Subgroup_7_norank、RB41_norank、Subgroup_6_norank；樣地M88-9中有8種，分別是，WD2101_soil_group_norank、Caenimonas、TRA3-20_norank、牙球菌屬、Ferruginibacter、uncultured_norank、Subgroup_7_norank、RB41_norank、Subgroup_6_norank。在3個樣地中均為有土壤生物結皮的地方屬水平的微生物種類多與未結皮地。

WD2101_soil_group_norank、玫瑰彎菌屬、Caenimonas、43F-1404R_norank、水庫桿菌屬、uncultured_norank和馬賽菌屬類的土壤微生物含量在結皮層高于未結皮層。其中Caenimonas、水庫桿菌屬和馬賽菌屬類的土壤微生物都屬于 變形菌門類。TRA3-20_norank、微鞘藻屬、牙球菌屬、Ferruginibacter、RB41_norank和Subgroup_6_norank屬類的土壤微生物含量在未結皮層高于結皮層。牙球菌屬、RB41_norank和Subgroup_6_norank屬類的土壤微生物屬于酸桿菌門類。

圖4 屬水平土壤細菌群落組成百分數Fig.4 Percentage of bacterial community compositionat the genus level

圖5 屬水平土壤細菌群落相對豐度Fig.5 The relative abundance of bacterial communities at the genus level

2.4 PCA分析

PCA分析通過對復雜數據降維，去除冗余數據，揭示數據背后簡化分析技術。樣本越相似，PCA圖上它們的距離越相近。如圖6所示，不同顏色分別代表不同地點的樣本，其中橫坐標和縱坐標是相對距離，并無實際意義。在圖4中樣本在縱軸方向分開，則說明縱軸是導致樣本分開的主要因素，也說明縱軸代表的因素可能是樣本組成差異的原因。圖6是通過16s rDNA 對樣本進行主坐標軸分析，顯示6個樣本土壤中(3個結皮和3個未結皮)分布較為分散，在PC3為8.16%水平下呈現出有土壤生物結皮的M46_48、M85_87和M70_72均在它們對應的樣地未發生土壤生物結皮樣地M49_51、M88_90和M73_75的上側。且在同一采樣地點的M85_87，M88_90、M70_72，M73_75和M46_48，M49_51距離相對較近。說明采樣地點是否發生土壤生物結皮對土壤微生物細菌群落分布有較大的影響。

圖6 主坐標分析圖(16s rDNA)Fig.6 Principal co-ordinates analysis(16s rDNA)

3 討論

土壤微生物多樣性是土壤質量的良好指示劑[13]。土壤是否發生生物結皮與土壤微生物群落結構的關系對了解高寒草甸土壤微生物多樣性和土壤生物結皮與青藏高原“黑土灘”草地退化有重要的作用[14]。

3.1 門水平群落結構分析

在本研究中6個樣地中在門水平下的優勢群落組成相似，但其相對豐度在不同樣地之間存在差異(圖2)。在五種門水平的細菌群落中，均為變形菌門Proteobacteria的相對豐度為發生土壤生物結皮的樣地高于未結皮土壤。而酸桿菌門Acidobacteria和放線菌門Actinobacteria則相反，在未結皮土壤中豐度高于生物土壤結皮的樣地的土壤，這與劉柯瀾的研究結果相似[15]。這可能是因為發生土壤生物結皮導致土壤理化性質發生變化，對微生物的選擇導致的結果。例如變形菌門類Proteobacteria的微生物多為兼性或者專性厭氧及異養生活微生物。酸桿菌門Acidobacteria和放線菌門Actinobacteria在未結皮土壤中豐度高于生物結皮土壤的原因可能是酸桿菌門Acidobacteria和放線菌門Actinobacteria的微生物主要降解纖維素甚至是難降解的芳香族化合物，促進土壤礦化作用。在發生土壤結皮區域水分含量低于周圍未發生土壤生物結皮土壤[16-17]。酸桿菌門Acidobacteria和放線菌門Actinobacteria的微生物在環境中的分布主要受水分的影響，也支持發生土壤生物結皮層酸桿菌門Acidobacteria和放線菌門Actinobacteria的微生物豐度低于未發生土壤生物結皮的結論[18]。另外土壤生物結皮使土壤pH下降，為酸桿菌提供了生長環境[17]。在屬水平群落結構分析中也證實形菌門類Proteobacteria的Caenimonas、Piscinibacter和Massilia也是在生物結皮土壤的豐度高于未形成土壤生物結皮土壤。Acidobacteria門類的Blastocatella、RB41_norank和Subgroup_6_norank屬的豐度在有生物結皮的土壤中大于無生物結皮的土壤。

3.2 門水平群落多樣性分析

在“黑土灘”退化人工草地土壤微生物中，變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、酸桿菌門Acidobacteria、浮霉菌門Planctomycetes、放線菌門Actinobacteria均為優勢門類。這些菌群在其他一些研究中也被認為是優勢種群。2003年Buckley和Schmidt，2015年Tang K等人研究認為變形菌門Proteobacteria、酸桿菌門Acidobacteria、浮霉菌門Planctomycetes、放線菌門Actinobacteria、Verrucomicrodetes和擬桿菌Bacteroidetes是農業類土壤微生物的優勢門類[18-19]。在本試驗高寒草甸中的5種門類的土壤微生物均包含于以上研究中的6種，但是農業類土壤微生物的優勢門類中的Verrucomicrodetes卻不是本試驗中高寒草甸土壤微生物中的優勢門類。這說明高寒草甸土壤微生物與農業土壤微生物相比即有相似性又有其獨特性。Nagy等2005年對索諾蘭沙漠地區，Gundlapally和Garcia-Pichel等2006年對克羅打地區的研究結果也與此類似[20-21]。在本研究中“黑土灘”退化人工草地土壤微生物中門水平下的優勢種類均為以上6種門類，說明在高寒草甸上無論是否發生土壤生物結皮，其土壤微生物的優勢門類都相同，與其他生境中的土壤微生物在門水平下的優勢種類既有相似性又有差異性。

3.3 屬水平群落結構分析

屬水平群落結果顯示(圖4)，在土壤生物結皮區域，屬水平土壤細菌相對豐度大于1%代表菌群種類多于未發生土壤生物結皮區域。土壤生物結皮的形成可顯著增加土壤有機質和土壤全氮[22-23]，并對養分有富集作用。這可能是導致土壤生物結皮的區域其土壤細菌相對豐度大于1%的種類多于未結皮土壤細菌相對豐度的原因。WD2101_soil_group_norank、Roseiflexus、Caenimonas、43F-1404R_norank、Piscinibacter、uncultured_norank和Massilia屬類的土壤微生物含量在結皮層高于未結皮層(圖5)。其中Caenimonas、Piscinibacter和Massilia屬類的土壤微生物都屬于Proteobacteria門類。而在土壤微生物門水平細菌群落結果則顯示Proteobacteria門類細菌在結皮層含量高于未結皮層。TRA3-20_norank、Microcoleus、Blastocatella、Ferruginibacter、RB41_norank和Subgroup_6_norank屬類的土壤微生物含量在未結皮層高于結皮層(圖5)。Blastocatella、RB41_norank和Subgroup_6_norank屬類的土壤微生物屬于Acidobacteria門類。在土壤微生物門水平細菌群落結果則顯示Acidobacteria門類細菌在結皮層含量低于未結皮層。

3.4 β多樣性分析

PCA分析結果認為，與是否發生土壤生物結皮相比，采樣地點對微生物群落組成的影響更大。在本試驗中同一采樣地點的微生物群落距離更近(圖6)，說明同一采樣地點無論是否發生土壤生物結皮其距離都較近。這說明生境比是否發生土壤生物結皮對土壤微生物群落的影響更明顯。這可能是因為土壤植物主要是以植物殘體為營養源，而不同生境中植物群落結構可能是不一樣的[24-25]。這一點在土壤微生物優勢種群及其豐度在采樣地點和是否發生土壤生物結皮的變化規律中也有體現。

4 結論

在高寒草甸 “黑土灘”人工草地上，有土壤生物結皮的土壤中，屬水平土壤細菌群落多樣性高于無生物結皮土壤，門水平土壤細菌群落結構也有類似的結果。因此，本研究認為土壤生物結皮的形成與土壤中微生物群落結構的變化密切相關，土壤生物結皮的發生反映著土壤微生物結構的變化。