貝加爾針茅草原土壤線蟲與微生物群落特征及其相互作用

張愛林， 趙建寧， 洪 杰， 楊殿林*

(1. 農業部環境保護科研監測所，天津 300191； 2. 沈陽農業大學園藝學院，遼寧 沈陽 11086；3. 內蒙古鄂溫克旗草原工作站，內蒙古 巴彥托海 021100)

中國北方溫帶草原一直以來廣泛采用自由放牧的土地利用方式，牛、羊等家畜在進行采食、踐踏和排泄等活動時會對草原產生多方面的影響[1]。不合理的土地利用方式及過大的土地利用強度會影響草原植被，引起草原植被退化，草場質量下降[2]。氮肥是草原生態系統最主要的限制因素[3]，施氮作為提高草地生產力和恢復草地退化的有效途徑和方法，已經被廣泛使用[4]。目前研究結果均有表明，施氮肥會增加草地生長系統的地上生物量，且地上生物量的增加幅度與施肥梯度呈正相關，也就是施氮在短期內能加速草原生態系統生產力的恢復[5-6]。相比較于施肥對地上生物量的顯著影響，施肥對于地下生物群落群落和生態環境的影響遠比對地上生物量的影響要復雜。而且相比較對地上生產力，施氮對地下生態系統和土壤理化環境的影響更為重要[6]。

土壤線蟲和土壤微生物是草地地下生態系統的重要組成部分，也是土壤物質循環和能量流動的主要參與者，是土壤生態系統中最活躍的部分。因此，土壤線蟲及微生物多樣性及其相關性能夠作為生態系統功能的敏感指標，較早地指示草地生態環境變化和生態系統功能的變化。研究掌握土壤動物和土壤微生物多樣性和相關性及其在外界施肥條件下對土壤環境和地下生態系統的影響是生態學領域關注的問題之一，在草原生態系統保護、恢復及重建中具有重要理論和實踐意義[7]。

貝加爾針茅(Stipabaicalensis)草原是亞洲中部草原區所特有的草原群系，是草甸草原的代表類型之一。自20世紀80年代以來，由于放牧、刈割等不合理的利用制度，貝加爾針茅草原發生不同程度的退化，是中國草原主要的退化草地類型之一[8]。本研究以貝加爾針茅草原為研究對象，通過外界施氮，探討貝加爾針茅草原土壤線蟲和微生物群落的相關性，研究施氮對貝加爾針茅草原地下生態環境的影響，對于制定科學的草地生態系統管理對策，實現天然草地的可持續發展具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗樣地概況

本試驗研究區域位于內蒙古呼倫貝爾市鄂溫克旗境內(48°27′～48°35′ N，119°35′～119°41′ E)，地帶性植被為貝加爾針茅草甸草原，屬于半干旱大陸性季風氣候。海拔高度760 m，年均溫-1.6℃，年降水量328.7 mm。土壤類型為暗栗鈣土。0～20 cm土壤表層全氮 1.74 g·kg-1，全磷0.35 g·kg-1，土壤pH值7.4，土壤容重1.26 g·cm-3。試驗地四周用圍欄保護。優勢植物為貝加爾針茅、羊草(Leymuschinensis) 。常見植物有羽茅 (Achnatherumsibiricum) 、日蔭菅(Carexpediformis) 、線葉菊(Filifoliumsibicum)、腎葉唐松草(Tnalictrumpetaloidoum)、扁蓿豆(Pocockiaruthenica)、草地麻花頭(Serratulakomarovii)、糙 隱 子 草(Cleistogenessquarrosa) 和寸草苔 (Carexduriuscula)等，共有植物66種，分屬21科49屬。

我們選擇地形平坦，植被典型的地段自2014年6月開展長期氮素添加試驗。試驗施氮素處理強度和頻度參考國際上同類研究的處理方法[9-10]，設置氮素添加水平為 0、15、30、50、100、150、200、300 kg N·ha-1·yr-1，4次重復，小區面積64 m2(8 m×8 m)，小區之間間隔2 m，重復間距設5 m隔離帶。施肥每月1次，于每年6月中旬和7月中旬分兩次施肥。按照施氮量換算成小區 NH4NO3施用量。為能夠盡可能均勻施肥，生長季(5～9月)根據氮處理水平，將每個小區每次所需要噴施的氮素(NH4NO3)溶解在8 L水中(全年增加的水量相當于新增降水1.0 mm)后，均勻噴施到小區內，CK樣方同時噴灑相同量的水。

1.2 樣品采集與處理

于8月中旬，按照“隨機”、“等量”和“多點混合”的原則，在各個處理小區內用直徑為5 cm的土鉆，按照S型取樣法選取10個點，去除表面植被，取0～20 cm土壤混勻過篩，去除根系和土壤入侵物，采用“四分法”選取土樣，迅速裝入無菌封口袋，冰盒冷藏并迅速運至實驗室。樣品前處理分成兩部分，一部分土樣于4 °C保存用于線蟲分析；一部分土樣置于-70 °C超低溫保存，供土壤微生物分析用。

1.3 土壤線蟲的測定及分析

每個樣品取土壤鮮樣50 g，利用改良淺盤法[11]在25 °C下分離48 h。將分離后的線蟲加入固定液(9%福爾馬林、1%甘油和2～3滴冰醋酸)保存，利用顯微鏡進行計數和到屬水平的鑒定，計算每100 g干土中含有線蟲的條數。鑒定采用形態學方法鑒定，鑒定參照《De nematoden van Nederland》《Dorylaimida—Free-living，Predaceous and Plant-parasitic Nematodes》《中國土壤動物檢索圖鑒》《植物線蟲分類學》。根據線蟲頭部形態學特征和取食生境將土壤線蟲分為不同的c-p類群和4個功能營養類群:食細菌類群(Bacterivores)、食真菌類群(Fungivores)、植物寄生類群(Plantparasites)、捕食類群/雜食類群(Predators/Omnivores)[12]并計算土壤線蟲群落結構生物多樣性指標。

1.4 土壤微生物磷脂脂肪酸的測定分析

取-70 ℃保存的新鮮土樣進行凍干處理，采用Bligh-Dyer法進行土壤微生物脂類的提取和磷脂脂肪酸[13]分析。取2 g凍干土，加氯仿-甲醇-檸檬酸緩沖液(1∶2∶0.8)震蕩離心提取總脂，經氮吹后，加氯仿經活化柱(SiO2鍵合柱)分離得到磷脂脂肪酸，將分離后的磷脂加入甲醇甲苯混合液進行甲酯化，氮吹后加入內標，然后采用HP6890氣相色譜-HP5973質譜聯用儀(GC-MS)[14]進行分析。測定時，以十九烷酸甲酯(19∶00)作為內標，脂肪酸的定量方法采用峰面積和內標曲線法，再根據不同脂肪酸的分子結構劃分為不同的微生物類群[15-16]。

根據不同微生物群落脂肪酸的分子結構和基團位置，將其分為細菌(革蘭氏陽性G+和陰性菌G-)、真菌、放線菌等。其中，15∶00、i15∶00、a15∶00、16∶00、i16∶00、16∶1w5、16∶1w9、16∶1w7t、17∶00、i17∶00、a17∶00、cy17∶00、18∶1w5、18∶1w7、18∶1w7t、i19∶00、a19∶00、cy19∶00等屬于細菌；i14∶00、i15∶00、a15∶00、i16∶00、i17∶00、a17∶00等為革蘭氏陽性細菌；16∶1w7t、16∶1w9c、16∶1w7c、18∶1w7c、18∶1w9c、cy17∶00、cy19∶00等為革蘭氏陰性細菌；18∶1w9、18∶2w6,9、18∶3w6、18∶3w3等為真菌；10me16∶00、10me17∶00、10me18∶00等為放線菌[17]。PLFA總量，以檢測得到的脂肪酸加和表示。

1.5 數據分析

數據經過Excel前期處理后，使用SPSS 17.0和origin 9.1進行單因素方差分析和一般線性模型分析，采用LSD進行多重比較檢驗，顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 氮素添加水平下土壤微生物的群落和活動

在本實驗樣地0～20 cm表層土壤中，共檢測出34種生物標記的磷脂脂肪酸，其中細菌群落含量最高，占到PLFA總量的47.1%～65.6%；其次是真菌群落，占總PLFA的6.8%～19.7%(圖1C、D)。分析表明，隨著施氮水平的增加，土壤中總PLFA的含量變化不顯著(圖1A)，說明施氮對貝加爾針茅草原表層土壤的微生物群落數量無顯著的影響。但隨施氮水平的增加，土壤中的細菌群落和真菌群落隨施氮水平的改變有顯著變化；土壤中的細菌群落在N15和N30的低氮條件下顯著高于不施氮的空白對照，而在>N50的高氮條件下土壤細菌群落的增加量降低，與低氮處理相比顯著減少(圖1C)；土壤中的真菌群落在不同的氮處理水平下有差異，但差異不顯著，在N150的高氮處理時真菌群落顯著低于N30的低氮處理(圖1D)。在不同的施氮水平下，土壤中的真菌/細菌在14.5%～32.5%，都遠小于50%，說明土壤中的微生物群落以細菌為主；同時，土壤中的真菌/細菌的變化趨勢與土壤中的真菌變化趨勢一致(圖1B)，說明施氮對土壤中的真菌和細菌群落有一定的影響，其中對真菌的影響遠高于細菌。

圖1 不同氮素添加水平土壤總PLFA、真菌/細菌、細菌群落、真菌群落的變化Fig.1 Changes of soil total PLFA, fungi / bacteria, bacterial community and fungi communities at different nitrogen levels

表1 不同氮素添加水平土壤線蟲生態指標Table 1 Ecological indicators of soil nematodes under different nitrogen application levels

指標Index物種數Number of species豐富度SR多樣性H'均勻度J’成熟度MI通路指數NCR結構指數WIN0 29ab3.73ab2.63a0.87ab8.71ab0.62a2.91aN1534a3.92a2.70a0.88ab9.92ab0.60a4.46aN3033a3.87a2.76a0.90b9.65a0.60a3.96aN5028b3.16b2.57a0.89a8.17b0.62a3.97aN100 29ab3.42ab2.54a0.86b8.53ab0.68a3.53aN150 27ab3.47ab2.50a0.85b8.22ab0.65a3.50aN20031a3.87a2.54a0.83b9.20ab0.60a4.34aN300 29ab3.49 ab2.56a0.86b8.65ab0.64a3.66a

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Noye: Different letters in the same column indicate significant differences at the 0.05 level

2.2 氮素添加水平下土壤線蟲的分布和群落結構

分析樣地土壤中土壤線蟲的群落結構發現，隨著施氮水平的增加，土壤線蟲的密度變化并不顯著(圖2)。在對土壤線蟲群落的分析中，根據線蟲頭部形態學特征和取食生境將土壤線蟲分為4個功能營養類群：食細菌類群(Bacterivores)、食真菌類群(Fungivores)、植物寄生類群(Plantparasites)、捕食類群/雜食類群(Predators/Omnivores)[19]。隨著施氮水平的增加，食細菌類群線蟲在N100后隨施氮處理的增加而減小(圖3A)；食真菌線蟲隨施氮水平的增加波動變化，在低氮水平隨施氮水平的增加而增加，在N100時達到最大值，在N300時顯著降低(圖3B)；植物寄生類群線蟲在不同施氮水平下無顯著變化，但施氮處理下的植物寄生類群線蟲數都小于不施氮的空白處理，在N15、N150、N300時顯著低于空白對照(圖3C)；捕食類群/雜食類群線蟲在不同的施氮水平下都小于空白對照，但差異不顯著(圖3D)。

在不同的施氮處理下，土壤線蟲的多樣性(H’)、通路指數(NCR)、結構指數(WI)變化差異不顯著，說明施氮對土壤線蟲的稀有物種和土壤中線蟲類群的比值影響不顯著。施氮對土壤線蟲的物種數量和多樣性有顯著影響且變化趨勢一致，在施氮水平較低，N50物種數和多樣性降低。土壤線蟲均勻度在N50的高氮區，均勻度都顯著降低。在不同的施氮水平下，成熟度的變化不顯著，但在N50時達到最大值，即土壤線蟲群落受外界干擾最小，這也與在N50土壤線蟲均勻度最高的結構相一致(表1)。

圖2 不同氮素添加水平土壤線蟲豐度的變化Fig.2 Changes of soil nematode abundance under different nitrogen application levels

圖3 不同氮素添加水平土壤線蟲類群的變化Fig.3 Changes of Soil Nematode in Different Nitrogen Levels

2.3 氮素添加水平下土壤線蟲和微生物的相互作用

在不同的施氮水平下，不同類群的土壤線蟲和土壤微生物的總PLFA、細菌群落、真菌群落和真菌/細菌的相關性不同(表2)。在不同的施氮水平下，土壤中的食細菌類群線蟲、食真菌類群線蟲和捕食類群/雜食類群線蟲與土壤中微生物的磷脂脂肪酸總量、細菌群落和真菌群落之間都沒有明顯的相關性，即在不同施氮水平下土壤微生物群落的改變，對土壤中自由生活類群線蟲(食細菌類群線蟲和食真菌類群線蟲)和雜食類群線蟲沒有顯著的影響。但土壤中植物寄生性類群線蟲和土壤中細菌、真菌和真菌/細菌之間有明顯的線性關系。植物寄生類群線蟲和土壤中的細菌群落、真菌/細菌呈顯著正相關，與土壤中的真菌群落呈極顯著正相關，說明在不同施氮水平下土壤中細菌和真菌群落的改變顯著影響土壤中植物寄生類群線蟲群落(圖4)。

在不同的施氮水平下，土壤微生物群落的改變對土壤線蟲不同生態指標的影響不同。土壤中真菌/細菌與土壤線蟲的豐富度(SR)呈顯著正相關，與土壤線蟲的結構指數(WI)呈極顯著負相關。土壤真菌群落與土壤線蟲的均勻度(J’)呈顯著正相關，與土壤線蟲的結構指數(WI)呈極顯著負相關。說明土壤中真菌群落的增加或細菌群落的減少都會促進土壤線蟲物種豐富度的增加，同樣真菌群落的增加也會促進土壤線蟲均勻度的增加，增加線蟲群落的穩定性。但當土壤真菌群落增加時，會顯著抑制瓦斯樂思卡指數增長，說明土壤真菌群落的增加會提高植物受線蟲感染的幾率，改變土壤礦化途徑，而土壤細菌群落和微生物的總量對線蟲群落和生態指標影響較小(表3)。

表2 土壤微生物與土壤線蟲群落的相關性Table 2 Correlation between soil microorganism and soil nematode community

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異顯著(P<0.01)。下同

Noye: * indicates significant differences at the 0.05 level；**indicates significant differences at the 0.01 level；The same as below

圖4 不同氮素添加水平植物寄生類群線蟲與土壤微生物群落的關系Fig.4 Relationship between plant parasitic nematodes and soil microbial community under different nitrogen application levels

表3 土壤微生物與土壤線蟲生態指標的相關關系Table 3 Correlation between soil microbes and ecological indicators of soil nematodes

豐富度SR多樣性H'均勻度J’成熟度MI通路指數NCR結構指數WI總PLFATotal PLFA0.070-0.151-0.078-0.130-0.315-0.141真菌/細菌Fungi/Bacteria0.454*0.3680.312-0.100-0.112-0.542**細菌 Bacteria0.1960.104-0.0150.3250.057-0.287真菌 Fungi0.3350.3850.428*-0.047-0.033-0.575**

3 討論

3.1 土壤線蟲和微生物對施氮處理的響應

施肥對植物地上生物量、土壤理化性質、土壤養分和植物根系分泌物等都有顯著影響[18-19]，而土壤微生物的群落結構和數量也受到以上因素的影響[20]，說明施氮會對土壤微生物的群落和數量產生一定的影響。本實驗通過磷脂脂肪酸法測定土壤微生物的群落發現，在貝加爾針茅草原進行不同水平的施氮處理，對土壤總PLFA含量影響不顯著，這與Shicheng Zhao等[21]的研究結果相一致，說明施氮對草甸草原土壤微生物的總量無顯著影響。但在不同的施氮水平下，土壤細菌群落數量出現波動，在不同施氮水平下細菌群落變化不顯著，但施氮處理下的細菌群落都顯著高于空白對照，這與Yuji Jiang等[22]的研究結果相一致，這說明施氮可以顯著增加土壤細菌群落的數量，原因可能由于草原土壤養分匱乏，施氮促進了草原植被的顯著增長，使植物根系分泌物增加，促進了細菌群落的增長[23]。而不同施氮水平對土壤真菌群落和土壤真菌/細菌的影響結果相同，在N100的高氮區土壤真菌群落顯著降低，這也說明草原不同施氮水平對土壤真菌的影響大于對土壤細菌的影響，這可能是由于真菌菌絲更有助于吸附和吸收土壤中植物根系及其他殘體的養分，對環境適應性更強，與施氮對植物的影響趨勢相似[24]。

不同梯度的施氮處理對土壤線蟲的影響與土壤微生物的相似，施氮對土壤線蟲的總量也無顯著影響，在施氮處理下食細菌類群線蟲、食真菌類群線蟲、植物寄生性類群線蟲和捕食類群/雜食類群線蟲都有不同程度的下降，說明施氮對不同的線蟲類群都有一定程度的抑制作用，這可能是由于施氮處理影響了土壤理化性質和土壤環境，施氮引起土壤pH值的下降，土壤粒徑的改變和土壤肥力的增加[25]，改變土壤線蟲的生長環境，限制其生長。但隨施氮水平的增加，食細菌類群線蟲、食真菌類群線蟲和植物寄生類群線蟲都有不同程度的波動增長，這可能與土壤微生群落和植物生長的改變有關。同時，施氮也顯著降低了土壤線蟲的均勻度，改變線蟲的物種豐富度，說明施氮顯著影響了線蟲群落的穩定性，而在不同的施氮水平下線蟲的通路指數均小于0.75，說明施氮處理不影響食微線蟲的結構比例，土壤有機質分解途徑以真菌通道為主。

3.2 在施氮條件下土壤線蟲與微生物間的相互作用

本研究發現，在貝加爾針茅草原不同施氮水平下，食微線蟲類群(食細菌類群線蟲和食真菌類群線蟲)，捕食類群/雜食類群線蟲和土壤中微生物群落的PLFA總量，細菌類群，真菌類群和細菌/真菌類群無顯著的相關性，即土壤中微生物群落結構和數量的改變對土壤食微類群線蟲和捕食類群/雜食類群線蟲的群落數量無明顯影響。而植物寄生類群線蟲與土壤中的細菌群落，真菌/細菌呈顯著正相關，與土壤中的真菌類群呈極顯著正相關，說明土壤微生物與土壤植物寄生類群線蟲之間有明顯的相互促進的作用，且真菌群落與植物寄生類群線蟲的相互作用更為明顯。這可能是因為植物寄生類群對植物的侵染，為土壤中的微生物提供了更多的能量和營養來源[26]，而且有研究表明土壤pH對土壤線蟲的影響最大[27]，所以食微類群線蟲作為土壤線蟲的優勢類群，主要受環境酸堿性變化和土壤養分的影響，而捕 食 類 群 / 雜 食 類 群線蟲一般以食微線蟲或者植食類線蟲為食物來源[28]，所以與食微類群線蟲的變化相似。

本研究發現 在不同的施氮水平下，土壤真菌群落與土壤線蟲之間相關性大于土壤細菌群落，說明土壤真菌群落與土壤線蟲之間的相互作用更強。通過對土壤微生物群落與土壤線蟲的生態指標進行分析發現，土壤真菌/細菌和土壤真菌群落與土壤線蟲的豐富度和均勻度呈顯著正相關，而土壤真菌群落的影響大于細菌群落，說明土壤真菌群落的增加能促進土壤線蟲物種豐富度的增加和線蟲群落的穩定，而土壤真菌群落與土壤的結構指數呈極顯著負相關，且結構指數均大于1，說明土壤真菌群落的增加抑制了土壤線蟲結構指數的增長，植物受線蟲感染增加即食物寄生類群線蟲增多，這與前文土壤真菌群落與土壤植物寄生類群呈顯著正相關的結果相一致。

4 結論

貝加爾針茅草原在長期施氮處理下，土壤微生物群落總量無顯著變化，施氮對土壤真菌群落的影響大于對土壤細菌群落的影響。施氮改變了土壤線蟲的群落結構，降低了土壤線蟲的豐富度和穩定性。土壤中的真菌群落與土壤中植物寄生性類群線蟲具有相互促進的作用，同時與土壤線蟲的結構指數呈顯著負相關，增加了植物受線蟲感染的幾率。但土壤微生物與食微類群線蟲無明顯的相關性。