分子標記在稻瘟病研究中的應用

歐陽偉

摘 要 稻瘟病屬于水稻種植中一種常見的病害，給水稻產量和質量造成了較多的不利影響，因此，需要科研人員從分析生物學角度出發，應用分子標記技術對發生稻瘟病水稻的抗瘟基因進行研究，借助于該種基因研制可以有效抵御稻瘟病的水稻品種，以此控制稻瘟病的發病率，實現水稻生產數量和品質的提高。基于此，對當前稻瘟病的發病原因、抗病基因的研究情況進行了概述，結合研究成果分析了分子標記的定義，種類，重點介紹了分子標記在稻瘟病研究中的應用。

關鍵詞 稻瘟病；分子標記；基因；染色體；抗病

中圖分類號：S435.111 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.12.096

水稻（Oryza sativa L.）是全球最重要的一種糧食作物，世界上有超過1/3的人口以水稻為主糧。在我國，有65%的人口也是以水稻為主要口糧[1]。由病原菌Magnaporthe grisea引起的稻瘟病是水稻最重要的病害之一，俗稱水稻癌癥。該病害嚴重制約水稻生產，在稻瘟病大爆發年份，發病重的區域可造成水稻減產，減產幅度可以達到40%～50%，甚至絕產[2]，而且會影響稻米品質。

在水稻生產過程中，為了減少稻瘟病病害對于水稻的影響，常采用種植優質水稻品種、化學農藥法等手段進行防治，但由于藥物使用量不合理、水稻種植環境惡化，導致稻瘟病變異速度較快，應用常規防治方法干預病菌效果不理想，水稻抗病菌能力嚴重下降，而且過量使用農藥易導致環境污染問題[3]。根據目前的研究可知，抗病品種是防治稻瘟病最好的辦法。鑒定和發掘更多的抗瘟基因，并對之進一步定位克隆，通過多基因聚合，獲得持久的抗病品種，是現代育種家最直接的育種目標。

1 稻瘟病的研究現狀

1.1 稻瘟病抗性基因的定位與克隆

20世紀80年代，日本學者Kiyasawa等用經典遺傳學的方法鑒定出8個位點上的14個主效顯性抗稻瘟病基因，包括Pik位點的Piks、Pikp、Pikh、Pikm和Pik，Pita位點的Pita和Pita2，Piz位點的Piz和Piz1，以及Pii、Pia、Pish、Pib和Pit等。隨著分子標記水平的不斷發展，稻瘟病抗性基因的定位及復制得到了較快發展，已發現有87個抗稻瘟病基因，87個基因分布在除第3染色體上的其他11條染色體上，并有成簇分布的趨勢。其中，最大的3個基因簇分別位于水稻的第6、11、12染色體上。如第6染色體上已定位了14個抗性基因，第11染色體上定位了24個抗性基因，第12染色體上則已定位16個抗性基因。

1.2 稻瘟病產生的原因

稻孢菌（Pyricularia oryae）屬于半知菌亞門，為水稻稻瘟病的主要病原菌。水稻感染稻孢菌后，會在水稻中進行分生孢子、附著孢、侵染性菌絲的產生與分裂等一系列的變化。其具體過程是：稻孢菌以菌絲體和分生孢子的形式在稻草和稻谷上越冬，當第二年氣溫回升到20 ℃左右時候，遇降雨就會萌發累積分生孢子。孢子的萌發主要集中在在夜間12點至第二天早上6點。接觸到禾苗后，在合適的溫度、濕度下就會侵染禾苗，使禾苗產生病害。

2 分子標記在稻瘟病研究中的應用

2.1 分子標記概述

該種技術包括細胞學標記、分子標記、形態學標記、生物化學標記等遺傳標記形式，其中分子標記較其他方法優點較多：1）核酸，不局限于基因是否表達，不需要分析組織或器官特異性，不受季節環境的限制；2）遍及全部基因組，數量豐富，標記的數量不受限制；3）自然存在大量的等位變異，高多態性；4）共顯性多，很容易鑒別出基因型與雜合基因性；5）檢測手段方便快捷，良好的重復性；6）不影響目標形狀的表達，不關聯不良形狀。

2.2 分子標記的不同類型

分子標記包含的多態性標志類型較多，主要有隨機擴增多態性、簡單重復序列、擴增片段長度多態性、長度片段多態性、染色體或基因組原位雜交（GISH），mRNA差別顯示（mRNA DD），代表性差異分析法（RDA），任意引物PCR（AP-PCR），單引物擴增反映（SPARs）等。

2.2.1 隨機擴增多態性技術（RAPD）

該技術使用時可以在聚合酶鏈式反應（PCR）作用下，對物質基因組的DNA進行擴增，最終獲得PCR產物。該產物在生成過程中，DNA片段應用隨機引物來擴增，之后與模板結合方向互補存在，保證結合位點具有較短的結合位置。RAPD技術具有以下優點：1）無須獲得序列信息即可進行DNA片段的大量擴增；2）技術操作較為簡單，采集樣本數量少，技術應用成本支出較少；3）樣本遺傳基因為顯性。但是，應用該技術對樣本進行處理，易導致樣本中的純合子、雜合子無法被鑒別出來，堿基大小相同但是序列不同的片段，不能分開進行處理。

2.2.2 簡單重復序列（SSRs）

技術類型主要有（AC）n、（GA）n等，處于兩端的序列為單拷貝，在PCR下對隨機引物進行設計，在多次重復后，片段長度有著極大差異。技術在應用時，操作難度較低，便于工作人員直接操作，樣本多態檢驗結果較為精確。水稻中含有數量龐大的簡單重復序列，因此該技術的應用效果較好。在現階段的研究中，Mccouch等人選擇樣本，進行了簡單重復序列引物的開發，樣本引物數量共計為2 414對，標記點位2 240個，經過技術應用樣本標記數量有2 740個，之后再對樣本進行遺傳多樣性、基因定位等分析可知有著良好的應用價值。

2.2.3 擴增片段長度多態性（AFLPs）與長度片段多態性（RFLPs）

長度片段多態性屬于分子標記技術中最先被研究出的一種多態性標記形式，在遺傳連鎖領域中應用較多。技術應用時，可以直接破壞限制性內切酶識別位點，使得酶切片段可以在同一區域生成。應用特異性探針可以對存在差異的片段帶型進行檢測，遺傳片段以顯性遺傳形式來表示，不具有表型效應，標記點在不同等位時，不會發生互相干擾情況。但此法應用的成本高，樣本采集數量多，檢測技術操作復雜，長時間進行同位素檢測，易對工作人員造成人身損害。因此可以在該技術應用基礎上，聯合AFLPs技術來檢測。

2.2.4 酶切擴增多態性序列（CAPS）

技術原理為對限制性內切酶識別位點進行檢測，待位點出現喪失、重新生成時，需要使用引物重新設計位點。具體流程：DNA片段經PCR實現多態性位點的擴增，產生的產物應用限制性內切酶進行消解處理，酶切片段的大小應用電泳法來確定，該法多用來對樣本的基因型信息進行檢測。

2.2.5 候選基因技術（同源序列）（RGA）

對植物的抗病基因進行克隆，獲得的產物中有蛋白激酶、核苷酸結合位點等結構域，用于識別細胞信號、蛋白質等物質，并對上述物質進行傳導處理。在抗病基因克隆基礎上對DNA片段進行擴增，得到的片段序列非常相似。科研人員在對馬鈴薯的抗病基因產物的研究中，在原來基因上利用引物合成了RGA片段。

2.3 分子標記在稻瘟病研究中的應用

稻瘟病的研究中，使用分子標記技術可以促使水稻充分發揮出抗病作用，有助于研究人員對抗病基因進行克隆處理。在抗病基因以往的研究中，長度片段多態性利用率高，但隨著科學技術的發展，由于該技術存在檢驗操作難、結果得出時間長、檢驗費用和樣本數量多、適用范圍少等弊端，逐漸被簡單重復序列等技術所取代，極大地提高了抗病基因研究的效率和質量，對于人體不會造成嚴重傷害，安全性高，在目前的植物疾病基因定位研究中應用廣泛。

2.4 在水稻抗病基因育種中應用分析標記技術

為了提高水稻的種植質量，減少稻瘟病大面積暴發給農戶造成的經濟損失，需要不斷推廣與應用預防稻瘟病的水稻新品種培育方法。以往在品種培育時，多選擇目標性狀直接進行培育，獲得的水稻品種種植效果好，但品種培育數量較少，培育時間較長，該法的應用效果不理想。因此水稻種植人員在育種時，可以學習分子生物的相關知識，了解分子標記技術在農產品、植物培育時發揮的重要作用，依托該技術進行抗稻瘟病水稻的育種工作。在水稻育種中，使用該技術手段可以選擇水稻的隱性性狀，在作物生長期間可以在各個階段對DNA片段進行檢驗，分析片段是否發生變異以及變異的程度，是否有利于多基因聚合水稻的育種。該技術育種時的應用價值高，對于育種的操作要求較低，樣本數量要求不多，成本可以得到有效控制，培育出的水稻新品種對于生長環境有著良好的適應性。因此分子標記技術需要在水稻抗病育種中大量應用，以此促進諸多水稻種植農戶經濟收益的提升。

3 展望

當今科技日益發展，特別是生物信息學領域更是迅猛發展。分子標記技術雖然開發的時間不長，但應用范圍極廣。分子標記技術的廣泛應用最重要的限制因子是成本和利益，雖然從表面來看，分子標記花費的成本較傳統形態學標記高，但隨著分子標記在遺傳學的廣泛應用，各種標記分析技術已程序化而易于實施。分子生物學理論和技術的快速發展，必將不斷開發出成本低、信息量大、應用范圍廣的分子標記技術。在稻瘟病研究領域，應用分子標記來定位抗性基因已經取得了顯著成績。但也存在一些不足，如稻瘟病抗性基因的定位群體與育種群體存在脫節，基因定位的成果難于直接應用到育種研究上。在以后的研究中應該加強：1）在稻瘟病定位研究中選用育種材料來構建定位群體，縮短基礎研究與應用研究的距離；2）開發更多實用簡單易操作的分子標記技術，進一步促進分子標記輔助育種在實踐中的應用和推廣。

參考文獻：

[1] 康美花，曹豐生，陳紅萍，等.水稻稻瘟病抗性基因研究進展及其在育種上的應用[J].江西農業學報，2010，22（2）：95-98.

[2] 崔永，劉自旭.水稻稻瘟病抗性基因的研究[J].山西農業科學，2008，36（12）：40-43.

[3] 李楊，王耀雯，王育榮，等.水稻稻瘟病菌研究進展[J].廣西農業科學，2010，41（8）：789-792.

（責任編輯：趙中正）