多體素氫質子磁共振波譜與膠質瘤病理指標的相關性分析

沈 曉， 王爾松

復旦大學附屬金山醫院神經外科，上海 201508

多體素氫質子磁共振波譜(proton magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS)是一項無創性獲取活體組織細胞代謝及生化信息的技術，通過測定腦組織及腫瘤內代謝物濃度及比值的變化可實現對病變的定性與定量診斷。本研究分析了腦膠質瘤1H-MRS代謝參數與病理金標準的相關性，為臨床利用1H-MRS確定膠質瘤級別、了解膠質瘤的代謝情況及指導最大安全范圍全切除膠質瘤提供參考[1-2]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1月至2014年10月入住復旦大學附屬金山醫院的膠質瘤患者18例，所有患者未接受過開顱手術或放、化療。其中，男性12例，女性6例；年齡21～69歲，平均(40.3±15.3)歲。腫瘤主體位于額葉11例，顳葉2例，頂葉2例，島葉、基底節及丘腦各1例，腫瘤體積24.0～62.3 cm3。臨床表現：肢體乏力11例，言語功能障礙6例，嗜睡、頭痛4例。最終手術全切除11例，次全切除5例，僅行活檢2例。

1.2 常規磁共振成像及波譜檢查 術前1～2 d采用3.0 T磁共振(Siemens Magnetom Verio)，8通道頭部線圈。對比劑為釓噴酸葡胺(0.1 mmol/kg，GE Healthcare，Ireland)。常規磁共振掃描參數和序列：矢狀為T1W-FLAIR(TR/TE/TI 2 000/9/860 ms)，橫斷面TSE(TR/TE 6 000～7 540/95～98 ms)，橫斷面T1W-FLAIR(TR/TE/TI 2 000/9/860 ms)，橫斷面T2W-FLAIR(TR/TE/TI 8 500/94/2 440 ms)，橫斷面GRE序列(TR/TE 2 000/9 ms)。根據膠質瘤是否強化，導航采用MPRAGE(TR/TE/TI 1 900/2.94 /900 ms，FOV 250 mm×250 mm，層厚1 mm，176層)或TSE(TR/TE 3 200/332 ms , FOV 250 mm×250 mm，層厚2.0 mm，64層)。1H-MRS采用多體素點分辨波譜成像序列(pointed-resolved spectroscopy sequence, PRESS)，參數如下：TR/TE 1 700/135 ms，層厚15 mm，PES 16×16 , FOV 120 mm×120 mm。在PRESS序列激發前，應用CHESS序列抑制水峰。波譜檢查用T2W顯示膠質瘤最大徑層面。感興趣區包含膠質瘤增強區或T2W顯示的異常信號區、腫瘤周圍區域及對側正常腦組織。同時避免來自頭皮脂肪及顱骨脂質的污染，應用飽和帶減少化學位移產生的偽影，體素大小為7.5×7.5×15 mm3。波譜信號采集約需9 min，原始數據及解剖參考圖導入Syngo MultiModality工作站。

1.3 圖像與數據分析 各體素的1H-MRS參數數值在工作站由磁共振自帶軟件Spectroscopy計算獲得。通過擬合曲線獲取感興趣區代謝物的空間分布，在單個體素基礎上評估體素參數(高度、寬度、面積)。在解剖圖上疊加網格可以顯示每個體素的解剖部位。網格由256 (16×16)個體素組成，每個體素按序分配1個編號。

1.4 選擇與標記穿刺靶點 術前采集MRS原始數據和導航數據后均導入MAC Pro計算機中，根據MRS參數特征及常規磁共振圖像，分別在腫瘤核心區及腫瘤周邊區域連續選取5個左右穿刺靶點。靶點盡可能位于一直線上，且盡量避開功能區、傳導束及較大腦血管；由于高級別膠質瘤中心嚴重壞死或被破壞，對于波譜定量影響較大，亦酌情予以避開。完成設計穿刺軌跡后，記錄每個活檢靶點的編號，并在導航影像中標記備用。其中，腫瘤核心區界定為膠質瘤的強化區或T2高信號區，與腫瘤核心區1個體素距離的范圍界定為近瘤周，其余均定義為遠瘤周。

1.5 組織活檢 將標記好靶點的導航數據傳至導航系統工作站，根據手術計劃在導航系統軟件上將其與其他影像序列進行融合。所有穿刺操作由同一名高年資神經外科主治醫師完成。所有病例均在開顱手術前行導航下穿刺取材，以使所選取的體素與實際留取的組織標本精確匹配。穿刺術中應盡量使取材組織的解剖位置及體積與相應體素吻合，組織樣本可在靶點4個方向上抽吸獲取，抽吸后保留穿刺針3～5 min，確保穿刺后無活動性出血。

1.6 標本處理 18例患者術中平均穿刺5個活檢靶點，最終獲取89個標本。所有活檢標本經4%甲醛溶液固定后進行石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(H-E)染色。應用EnVision法進行免疫組織化學染色，所用一抗如下：CD34(Dako, 單克隆；1∶200)， 神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP，Dako, 克隆6F2, 單克隆；1∶200)，單克隆抗體(MIB-1，Dako, 克隆MIB-1, 單克隆；1∶200)。H-E和免疫組織化學染色結果由2位神經病理專科醫師根據2007年第4版《WHO中樞神經系統腫瘤》分類標準獨立進行診斷，對于形態和分級有爭論的病例經討論后達成一致意見。

1.7 免疫組織化學染色分析 (1)細胞密度：對蘇木精襯染細胞核的切片隨機取5個(×200)。GFAP陽性的細胞標記為腫瘤細胞，同一視野內的腫瘤細胞和膠質細胞計為總細胞，計算腫瘤細胞占總細胞的百分比。(2)CD34：先用低倍鏡(×40)找出腫瘤微血管密集區，然后在高倍鏡(×200)下找出CD34抗原染色陽性的內皮細胞，只要與臨近組織有明顯區別便計為1個血管，每個標本觀察5個高倍視野并取平均值作為該病例的微血管密度值。(3)MIB-1指數：對MIB-1免疫組化標記切片隨機取5個高倍鏡(×200)視野，計算腫瘤細胞占總細胞的百分比平均值。

1.8 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析，分別將MRS代謝物比值膽堿(Cho)/N-乙酰天冬酰胺(NAA)、NAA/肌酸(Cr)、Cho/Cr與上述3個病理指標進行Pearson線性相關分析。檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 病理情況 結果(表1)表明：18例患者中，Ⅱ級膠質瘤6例，Ⅲ級膠質瘤5例，Ⅳ級膠質瘤7例。共采集89個病理活檢標本，高級別(Ⅲ級及以上)膠質瘤都含有2種或以上級別膠質瘤成分。

表1 活檢標本及患者的病理分級

2.21H-MRS與病理指標的相關性 結果(表2)表明：Cho/NAA比值與細胞密度、CD34及MIB-1指數均正相關；NAA/Cr比值與細胞密度、CD34及MIB-1指數負相關；Cho/Cr比值與細胞密度正相關，與CD34及MIB-1指數之間無相關性。圖1為1例典型病例的1H-MRS及對應的病理檢查結果。

表2 MRS參數與病理指標間的關系

圖1 1H-MRS及病理檢查典型結果

患者男性，56歲，病理診斷為膠質母細胞瘤. A：白色實線框內為感興趣區，所有體素上標有Cho/NAA比值，白色虛線框內是穿刺靶點對應的5個體素，由淺入深定義為第1～5號靶點. B，C，D，E，F分別對應第1～5號靶點. B：Cho/NAA比值為1.1；C：Cho/NAA比值為2.0；D：靠近腫瘤核心，Cho/NAA比值為3.3，病理顯示腫瘤細胞重度浸潤；E：Cho/NAA比值為2.0，腫瘤浸潤程度與C基本相似；F：Cho/NAA比值為0.8， 受腫瘤浸潤程度較B輕

3 討 論

腦膠質瘤是常見的中樞神經系統腫瘤之一，我國發病率為3.13/10萬。該病因侵襲性強、致死率高、易復發而引起人們的關注。目前臨床常規MRI可以顯示膠質瘤形態學邊界[3]，但不能提供腫瘤內微脈管系統血管生成、代謝物改變或細胞構成等方面的信息。MRS能通過測定腦組織及腫瘤內某些代謝物的濃度及比值變化，實現對病變的定性與定量診斷，從而彌補常規MRI成像的不足。譜線是MRS主要的表現形式，代謝物的濃度用波譜圖特定頻率范圍內的波譜峰下的面積來表示[4]。本研究采用相對定量的方法表示代謝物濃度，采用3個參數，即Cho/NAA、NAA/Cr及Cho/Cr；用于對照的病理學指標為膠質瘤細胞密度、CD34及MIB-1標記指數。

細胞密度是指腫瘤細胞數與總細胞數的百分比。McKnight等[5]報道，Cho/NAA、Cho/Cr與膠質瘤細胞密度呈正相關；Croteau等[6]用成層法分析發現，上述代謝產物與膠質瘤級別也有很好的相關性；Ganslandt等[7]研究顯示，膠質瘤中心區域Cho/NAA比值較瘤周更高。本研究結果與上述研究結論基本一致。NAA含量多少與神經元及軸突數量有關；Cho反映了細胞膜的運轉功能，細胞膜前體及膽堿類代謝物的降解產物增加導致Cho升高[8-10]。本研究發現，Cho/NAA、NAA/Cr及Cho/Cr均與細胞密度之間存在相關性，其中Cho/NAA、Cho/Cr與細胞密度正相關，NAA/Cr與細胞密度負相關。其原因在于：膠質瘤細胞快速增殖使細胞膜代謝異常增高，導致Cho增高，而神經元的破壞及軸突數量減少導致NAA下降。McKnight等[5]還認為，Cho/NAA是識別膠質瘤變化及膠質瘤細胞浸潤程度的敏感指標。本研究顯示，該指標與細胞密度的相關指數高于NAA/Cr及Cho/Cr，可能原因在于Cho/NAA比值能反映腫瘤區的化合物含量的整體變化；隨著腫瘤惡性程度的升高，該比值進一步升高[11-12]。

血管生成是膠質瘤的一個重要特征。CD34作為常用的血管內皮標志物，可以反應新生血管的生長代謝狀況。Toyooka等[1]報道，Cho總含量與腫瘤血管容量有很好的相關性。本研究結果顯示，Cho/NAA比值與CD34正相關，NAA/Cr與CD34負相關，與研究[1]結果相似。然而，本研究顯示，Cho/Cr與CD34無相關性，原因可能在于本研究基于相對定量，且Cr與腫瘤浸潤程度相關性差[13]。Cho/Cr雖然不能直接反應腫瘤微血管生成情況，但是高Cho濃度往往提示腫瘤細胞增殖活躍，腫瘤細胞密集區局部缺氧刺激血管內皮生長因子釋放，導致新生血管密集生成。而腫瘤代謝活躍的區域同時伴有神經元的破壞，導致NAA下降。因此，推測Cho/Cr及NAA/Cr可以間接反映膠質瘤新生血管的生長情況。

Ki-67是一種與細胞增殖密切相關的核抗原。MIB-1抗體可與Ki-67結合，用于預測腦腫瘤級別、生長代謝及預后。目前，關于MIB-1指數與膠質瘤MRS參數及預后關系的研究[5-6]較多。Nafe等[14]研究顯示，Cho/NAA與MIB-1指數不相關；Tamiya等[8]認為，Cho/NAA、Cho/Cr與MIB-1指數正相關；Shimizu等[15]研究結果認為，Cho濃度與MIB-1正相關，而與Cho/NAA、Cho/Cr值的線性相關性較弱。造成上述研究結果差異的原因可能在于其多采用單體素，同一膠質瘤內只留取1個組織樣本。由于單體素波譜體素范圍過大，容易受腦脊液、壞死成分等影響，壞死成分較多的體素內代謝物濃度被稀釋，導致相對定量比值偏倚，從而干擾研究結果。另外，體素的大小往往大于病理活檢獲取的組織，通過穿刺活檢獲取的組織樣本不能反映整個體素內的組織代謝信息。即使進行開顱手術活檢，由于術中腦移位，導航下取樣部位也往往不能與MRS采樣體素精確匹配。本研究為避免以上不足，所有病例均采用多體素，術前利用自主設計軟件Biopsy NAV將靶點體素標記于導航影像中，并在開顱術前穿刺獲取組織，以避免腦移位，較以往研究更為精確。本研究發現，Cho/NAA與MIB-1指數正相關，NAA/Cr與MIB-1指數負相關，與研究[8,15]相似；而Cho/Cr在本次研究中與MIB-1指數沒有相關性，可能與本研究樣本中膠質母細胞瘤所占比例偏高，Cr減少較為明顯[16]有關。

本研究發現，MRS相對定量參數與膠質瘤細胞的密度、CD34及MIB-1指數密切相關，而以上病理指標與腫瘤的惡性程度及浸潤程度正相關[12-13,16]。這提示可以通過MRS識別膠質瘤及周邊區域的代謝變化，對膠質瘤在術前進行分級、鑒別診斷及評價療效等，并依據MRS參數的變化識別膠質瘤的浸潤范圍，為指導臨床最大安全范圍切除腫瘤提供參考。本研究中連續選取活檢靶點，這樣的連續性與膠質瘤向周邊浸潤的生物學行為相一致。病理結果顯示：高級別膠質瘤中均含有2種或2種以上病理級別膠質瘤成分，低級別的成分大多位于腫瘤周邊(圖1)。這種分布既說明膠質瘤具有異質性，也證實了膠質瘤向周邊逐步浸潤生長的特點。此外，MRS參數的變化說明膠質瘤不是等距離浸潤周邊。圖1C和D組織同樣位于近瘤周，但其Cho/NAA比值不同，受腫瘤浸潤的程度也有明顯差異。C和E組織的Cho/NAA比值均為2.0，雖然距腫瘤核心區域的距離不等，但病理結果顯示兩者腫瘤浸潤情況基本相似。而圖1B相比于F組織雖然遠離腫瘤核心區域，但其Cho/NAA比值大于F，病理顯示B腫瘤浸潤的程度較F更嚴重。由此可見，膠質瘤病理與MRS參數相一致，這進一步證實了MRS準確性，說明與傳統MRI影像相比，MRS可能在判斷膠質瘤浸潤程度及范圍界定上更加精確。

活檢標本和體素之間精確配準是本研究的另一個優勢。本研究利用自行開發的標記軟件Biopsy NAV，在術前將穿刺靶點對應的體素標記在導航序列中，并在開顱手術前進行導航下穿刺獲取組織樣本，避免了目測誤差及腦移位等對穿刺精度的影響。因此獲取的MRS參數可以更準確反映活檢標本的代謝物改變。

綜上所述，本研究結果顯示，Cho/NAA、NAA/Cr及Cho/Cr和膠質瘤細胞密度、CD34及MIB-1指數之間存在密切關系，說明MRS可反映膠質瘤的代謝變化，進而為臨床提高腫瘤全切除率及制定有效的綜合治療方案提供依據。