血清類(lèi)黏蛋白1樣蛋白3基因單核苷酸多態(tài)性與兒童肺炎支原體感染相關(guān)哮喘的相關(guān)性

襲學(xué)芹， 畢玉娜， 谷亞星， 王金榮*

1. 山東省婦幼保健院小兒呼吸科，濟(jì)南 250014 2. 山東省立第三醫(yī)院小兒呼吸科，濟(jì)南 250031 3. 山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院兒科呼吸綜合科，濟(jì)南 250021

支氣管哮喘是一種呼吸系統(tǒng)頻發(fā)的異質(zhì)性疾病，多在凌晨發(fā)作和(或)夜間加劇。哮喘的臨床表現(xiàn)主要為反復(fù)發(fā)作的喘息、咳嗽、氣促和胸悶，以慢性炎性反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性為特征。呼吸道癥狀的嚴(yán)重程度和具體表現(xiàn)形式隨時(shí)間而變化，可伴有可變的呼氣氣流受限[1]。1970年，Berkovich等[2]首次報(bào)道，支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae，MP)與哮喘患兒喘息發(fā)作有直接聯(lián)系。近年來(lái)關(guān)于哮喘病因?qū)W的研究逐漸增多。有學(xué)者提出，MP感染為哮喘急性發(fā)作的重要誘發(fā)因素，并且是小兒哮喘遷延不愈、反復(fù)發(fā)作的主要獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

另外，目前認(rèn)為哮喘是一種多基因遺傳病，是由環(huán)境因素和遺傳因素相互作用而形成的。研究[3]證實(shí)，人血清類(lèi)黏蛋白1樣蛋白3(orosomucoid 1-like protein 3，ORMDL3)基因多態(tài)性與哮喘密切相關(guān)。ORMDL3基因位于17號(hào)染色體上，有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，編碼1個(gè)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的跨膜蛋白，可以調(diào)節(jié)Ca2+濃度，從而導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)，進(jìn)而成為炎性反應(yīng)發(fā)生的內(nèi)源性誘因。為探討ORMDL3基因單核苷酸多態(tài)性與兒童MP感染相關(guān)哮喘的相關(guān)性，本研究選取ORMDL3基因的rs4794820和rs7216389這2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析，比較各基因型在MP哮喘組與MP非哮喘組的分布差異，以期為兒童MP感染相關(guān)哮喘的早期識(shí)別和干預(yù)治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2015年12月山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院兒科診治的200例MP住院患兒。隨訪(fǎng)觀察1年以上，失訪(fǎng)6例，最后納入194例MP住院患兒為研究對(duì)象。所有入組患兒的治療及臨床資料使用均取得監(jiān)護(hù)人同意，并由其簽署知情同意書(shū)。根據(jù)我國(guó)2008年《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[4]及《2015年全球哮喘防治創(chuàng)議》[5]關(guān)于兒童哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將有反復(fù)或持續(xù)咳嗽和(或)喘息的患兒分為MP哮喘組，無(wú)上述表現(xiàn)的患兒為MP非哮喘組。收集所選患兒的血清免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)水平等資料。所有入選患兒均按照操作規(guī)范，測(cè)量身高、體質(zhì)量，并進(jìn)行體格檢查。

入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡3～12歲；(2)已于院外或入院后確診為MP，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組2013年修訂的《兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南》[6]和2015年《兒童肺炎支原體肺炎診治專(zhuān)家共識(shí)》[7]中MP的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)患兒或監(jiān)護(hù)人能正確理解研究?jī)?nèi)容，并能清楚描述患兒發(fā)病情況。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)3代直系親屬中有其他遺傳性疾病者；(2)存在先天性支氣管或肺發(fā)育異常、支氣管擴(kuò)張、氣管內(nèi)阻塞或氣管外壓迫、肺結(jié)核或先天性心臟?。?3)既往1年內(nèi)有反復(fù)或持續(xù)咳嗽及喘息表現(xiàn)；(4)近期合并其他病原體引發(fā)的呼吸道感染者；(5)無(wú)法取得家長(zhǎng)的知情同意者。

1.2 哮喘易感基因ORMDL3 rs4794820、rs7216389基因型檢測(cè) 所選兒童均于入院當(dāng)天治療前留取外周靜脈血3 mL，采用天根自動(dòng)核酸提取儀(TGuide S32 Nucleic Acid Extractor)提取目的基因ORMDL3。根據(jù)ORMDL3基因中哮喘易感的2個(gè)位點(diǎn)(rs4794820、rs7216389)序列設(shè)計(jì)引物。

rs4794820引物序列ASP1：5′-AGG AAG GAA GGA AGA AAG ACA G-3′，ASP2：5′-AGG AAG GAA GGA AGA AAG ACA A-3′，產(chǎn)物大小260 bp。rs7216389引物序列ASP1：5′-GCA ACC CTG GAA AGT CAC AAA CAT-3′，ASP2：5′-GCA ACC CTG GAA AGT CAC AAA CAC-3′，產(chǎn)物大小150 bp。

應(yīng)用Bio-MarkTM96.96動(dòng)態(tài)陳列集成流體通路(integrated fluidic circuit，IFC)Juno系統(tǒng)對(duì)哮喘易感基因ORMDL3的rs4794820、rs7216389基因型進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果用Fluidigm SNP Genotyping Analysis軟件分析。

1.3 血清IgE水平檢測(cè) 清晨空腹采集靜脈血2 mL，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清IgE水平。ELISA試劑盒為北京歐蒙生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，操作過(guò)程由檢驗(yàn)科醫(yī)師嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料的比較 194例患兒中，男性136例(70.1%)，女性58例(29.9%)，男女比例為2.3∶1。MP哮喘組患兒63例(32.5%)，其中，男性患兒45例(71.4%)，女性患兒18例(28.6%)，男女患兒比例為2.5∶1。MP非哮喘組患兒131例(67.5%)，其中，男性患兒91例(69.5%)，女性患兒40例(30.5%)，男女患兒比例為2.3∶1。MP哮喘組平均年齡(6.43±1.82)歲，MP非哮喘組平均年齡為(6.13±2.09)歲，兩組年齡構(gòu)成分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 MP哮喘與ORMDL3基因rs4794820位點(diǎn)基因型分布的關(guān)系 結(jié)果(表1)表明：在ORMDL3基因的rs4794820位點(diǎn)有 AG、GG、AA共3種基因型，MP哮喘組和MP非哮喘組在此位點(diǎn)均以純合子GG基因型的分布頻率最高、純合子AA分布頻率最低；兩組在此位點(diǎn)的基因型差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MP哮喘組GG純合子基因型和G等位基因頻率均明顯高于MP非哮喘組，但MP非哮喘組AA純合子基因型和A等位基因頻率明顯高于MP哮喘組；兩組此位點(diǎn)的等位基因差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 MP哮喘與ORMDL3基因 rs7216389位點(diǎn)基因型分布的關(guān)系 結(jié)果(表2)表明：ORMDL3基因的rs7216389位點(diǎn)有TT、TC、CC 共3種基因型，MP哮喘組和MP非哮喘組在此位點(diǎn)均以純合子TT基因型的分布頻率最高、純合子CC分布頻率最低；兩組在此位點(diǎn)的基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。MP哮喘組的TT純合子基因型和T等位基因頻率明顯均高于MP非哮喘組(P<0.05)；MP非哮喘組CC純合子基因型和C等位基因頻率明顯高于MP哮喘組。兩組此位點(diǎn)等位基因差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 MP哮喘組和非哮喘組患兒ORMDL3基因rs4794820位點(diǎn)的基因型分布 n(%)

*P<0.05與MP非哮喘組相比

表2 MP哮喘組和非哮喘組患兒ORMDL3基因rs7216389位點(diǎn)的基因型分布 n(%)

*P<0.05與MP非哮喘組相比

2.4 rs4794820 GG基因型和rs7216389 TT基因型的MP哮喘危險(xiǎn)度分析 結(jié)果(表3)表明：MP哮喘組在哮喘易感基因ORMDL3的rs4794820位點(diǎn)GG基因型分布頻率(60.3%)明顯高于AG+AA基因型(39.7%)，在rs7216389位點(diǎn) TT基因型(65.1%)明顯高于TC+CC基因型(34.9%)；MP非哮喘組在ORMDL3的rs4794820位點(diǎn)GG基因型分布頻率(42.7%)低于AG+AA基因型(57.3%)，在rs7216389位點(diǎn) TT基因型(45.0%)低于TC+CC基因型(55.0%)。MP哮喘組哮喘易感基因ORMDL3的rs4794820位點(diǎn)GG基因型分布頻率(60.3%)和rs7216389位點(diǎn) TT基因型分布頻率(65.1%)均明顯高于MP非哮喘組，兩基因型均為MP哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P=0.022，P=0.009)。

表3 哮喘易感基因ORMDL3 rs4794820 GG基因型和rs7216389 TT基因型的危險(xiǎn)度分析 n(%)

2.5 MP哮喘與血清IgE水平的關(guān)系 ELISA結(jié)果顯示：63例MP哮喘組患兒血清IgE水平升高者18例(28.6%)，131例MP非哮喘組患兒中19例血清IgE水平升高(14.5%)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.188，P=0.023)。

3 討 論

目前，我國(guó)兒童哮喘的總體控制水平尚不理想，其發(fā)病率在近年來(lái)不斷升高，給家庭及社會(huì)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)，也嚴(yán)重?fù)p害著兒童身心健康。哮喘是一種多基因遺傳疾病，遺傳度高達(dá)80%，具有明顯的家族傾向性，其發(fā)病與遺傳易感性和環(huán)境暴露的相互作用有關(guān)[8-9]。Ober等[10]的薈萃性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有118個(gè)基因與哮喘或變應(yīng)性疾病相關(guān)。有學(xué)者利用全基因組關(guān)聯(lián)性研究[3]分析發(fā)現(xiàn)，ORMDL3 基因是兒童哮喘的潛在候選基因。

MP是一種通過(guò)黏附及細(xì)胞毒效應(yīng)對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞形成直接損傷，也通過(guò)免疫機(jī)制引起肺部感染及肺外系統(tǒng)損傷的細(xì)胞外病原體[11]，可引起咽炎、支氣管炎和肺炎，誘發(fā)和加重哮喘[12]。目前，對(duì)于小兒MP有無(wú)性別差異，相關(guān)報(bào)道結(jié)論不一，考慮與不同地區(qū)男女患兒的構(gòu)成比差異較大有關(guān)。本研究納入的194例MP患兒中，男性患兒約為女性患兒的2.3倍，提示在本研究病例中男性MP感染陽(yáng)性率高于女性。已有文獻(xiàn)顯示，哮喘初發(fā)患者中，MP陽(yáng)性率為50%以上，復(fù)發(fā)患者中約為20%，而哮喘急性發(fā)作期的MP陽(yáng)性率為34.0%[13]。王曄等[14]研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒的MP陽(yáng)性率為48.8%，以學(xué)齡期兒童最高(達(dá)57.6%)。本研究顯示，MP哮喘組的MP陽(yáng)性率約為32.5%，比文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)值偏低。這可能與本次研究選取患兒的病情較重，而一些病情較輕或癥狀不典型的患兒未納入研究有關(guān)。

2007年，Nature首次報(bào)道ORMDL3基因單核苷酸多態(tài)性控制的遺傳變異與哮喘發(fā)作高度相關(guān)[15]，攜帶該基因遺傳變異的兒童患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)增加60%～70%。目前ORMDL3基因作為哮喘易感基因的相關(guān)機(jī)制研究正在進(jìn)行中。有研究[15]顯示，ORMDL3基因參與哮喘發(fā)病，推測(cè)ORMDL3能結(jié)合肌質(zhì)網(wǎng)，抑制其三磷酸腺苷酶(adenosine triphosphatase，ATP)活性，進(jìn)而降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的ATP濃度，促進(jìn)非折疊蛋白中激活轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)通路，活化的ATF6 通路促進(jìn)肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)炎性反應(yīng)，引起氣道高反應(yīng)性，使患兒對(duì)哮喘的易感性增加，引發(fā)哮喘。之后有研究提出，ORMDL3蛋白有3種異構(gòu)體[16]，是絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(serine palmitoyl transferase, SPT)的抑制劑，可作為鞘脂合成的限速酶，通過(guò)SPT抑制鞘脂的合成，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生，發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用；并且其可以獨(dú)立于過(guò)敏或炎性反應(yīng)。

目前，ORMDL3基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs4794820、rs7216389已經(jīng)被廣泛研究。其中，rs4794820參與上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)和氣道反應(yīng)性的調(diào)節(jié)；rs7216389則因其堿基由C改變?yōu)門(mén)，影響了ORMDL3基因的表達(dá)，從而在哮喘的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。韓國(guó)兒童中，rs4794820位點(diǎn)基因型為AG和AA的哮喘患兒相較于GG基因型的患兒，肺功能損害較低，嗜酸性粒細(xì)胞水平也更低[17]。Tavendale等[18]研究發(fā)現(xiàn)，蘇格蘭兒童中rs7216389位點(diǎn)為T(mén)C基因型的群體有發(fā)展為持續(xù)性哮喘的高危險(xiǎn)性。本研究發(fā)現(xiàn)，rs4794820位點(diǎn)GG基因型和G等位基因在MP哮喘組的分布頻率明顯高于MP非哮喘組，而rs7216389位點(diǎn)TT基因型和T等位基因在MP哮喘組的分布頻率明顯高于MP非哮喘組；在基因型危險(xiǎn)度分析中，rs4794820位點(diǎn)GG基因型和rs7216389位點(diǎn)TT基因型均是兒童MP相關(guān)哮喘的危險(xiǎn)因素，而rs4794820位點(diǎn)AA基因型和rs7216389位點(diǎn)CC基因型則可能是兒童MP感染相關(guān)哮喘的保護(hù)因素。

IgE屬于免疫球蛋白，可誘發(fā)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，導(dǎo)致患兒出現(xiàn)可逆的氣管阻塞，誘導(dǎo)哮喘發(fā)作。多項(xiàng)研究顯示，MP感染后可導(dǎo)致IgE水平升高；IgE既可以是感染源，也可以是特異的過(guò)敏原[19]。MP感染患兒具有更高水平的促炎細(xì)胞因子，總IgE水平升高[20]。MP引起的呼吸道炎性反應(yīng)和Th2細(xì)胞因子反應(yīng)增加導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞免疫功能失常，Th1/Th2比例降低。這是形成哮喘的啟動(dòng)因素，并在哮喘發(fā)展中成為維持因素，提示MP可誘發(fā)和加重哮喘。本研究顯示，MP哮喘組患兒血清IgE水平升高的比例高于MP非哮喘組，提示MP感染后IgE水平升高是支氣管哮喘患兒發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素，需要在臨床工作中引起重視，早期識(shí)別，以避免哮喘的發(fā)生。

綜上所述，MP相關(guān)哮喘患兒的病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，MP相關(guān)哮喘的發(fā)病率升高，而且ORMDL3基因rs4794820位點(diǎn)GG純合子基因型和rs7216389位點(diǎn)TT純合子基因型是兒童MP感染相關(guān)哮喘的易感基因型，rs4794820位點(diǎn)AA基因型和rs7216389位點(diǎn)CC基因型可能是其保護(hù)基因型；MP感染后血清IgE水平升高，是MP感染相關(guān)哮喘的潛在危險(xiǎn)因素。