白頭翁總皂苷及其主要成分抗腫瘤藥效及其構效關系的研究△

羅穎穎，嚴新，謝欣序，王木蘭，馮育林，楊世林，李俊**

(1.江西中醫藥大學 國家工程研究中心，江西 南昌 330006；2.江西本草天工科技有限責任公司，江西 南昌 330006；3.江西中醫藥大學 第二附屬醫院，江西 南昌 330006)

白頭翁Pulsatillachinensis(Bge.)Regel以干燥根入藥，是臨床常用中藥，具有清熱解毒、涼血止痢的作用，主要用于腸炎、熱毒痢等[1]。以白頭翁為主要的白頭翁湯則在臨床上廣泛用于腸道感染及其結腸炎等病癥[2-3]。近年來研究發現，白頭翁具有較好的抗炎、抗腫瘤、降血糖、抗補體等多種作用[4-13]。我們前期的工作表明，白頭翁總皂苷對癌有一定的抑制作用[14-15]，值得進一步深入研究。我們在提取分離得到可測成分含量90%以上的白頭翁總皂苷的基礎上，進一步對總皂苷中主要成分進行了分離鑒定，得到白頭翁皂苷B3、B7、B9、B11 4個單體成分，根據前期實驗結果，選取白頭翁皂苷抑制效果較好的人肝癌細胞SMMC-7721及人結腸癌細胞HT-29進行體外抗腫瘤活性觀察，并采用小鼠H22肝癌模型進行4個單體皂苷成分體內抗腫瘤活性觀察及其構效關系探討，以期尋找白頭翁皂苷中抗腫瘤作用的藥效物質基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料

人肝癌細胞SMMC-7721(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)；人結腸癌細胞HT-29和小鼠H22肝癌瘤株(中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心)。

白頭翁藥材，購于河北安國，產地為遼寧綏中市,經蘇州大學藥學院中藥教研室李笑然教授鑒定為毛茛科白頭翁屬植物白頭翁Pulsatillachinensis(Bge.)Regel的干燥根。白頭翁總皂苷(批號：20110701)制備方法[16]：取干燥的白頭翁藥材，10倍量70%乙醇回流提取3次，每次1 h，得白頭翁總皂苷。將白頭翁總皂苷用1.0% NaOH水溶液堿水解反應6 h后放冷過夜，用鹽酸調節pH 7.0，上D-101大孔樹脂柱，依次用水，40%、75%、95%乙醇洗脫；收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮，真空干燥即得棕褐色粉末狀白頭翁總皂苷。以白頭翁皂苷B3為對照品，紫外測的總皂苷含量達90%。其中含白頭翁皂苷B3 14.67%，白頭翁皂苷BD 3.09%，白頭翁皂苷B7 16.96%，白頭翁皂苷B9 7.79%，白頭翁皂苷B10 2.14%，白頭翁皂苷B11 10.15%(HPLC)。

本實驗中考察的白頭翁總皂苷中有效成分有：白頭翁皂苷B3(anemoside B3，化學名：3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷，B3)、白頭翁皂苷B7(anemoside B7，化學名：3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖-齊墩果酸皂苷，B7)、白頭翁皂苷B9(anemoside B9，化學名：3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖-齊墩果酸皂苷，B9)、白頭翁皂苷B11(anemoside B11，化學名：3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖-齊墩果酸皂苷，B11)，由江西本草天工科技有限責任公司提供，其中各單體成分的純度大于98%；環磷酰胺(CTX，江蘇豪森藥業股份有限公司，批號：101001)。

RPMI 1640培養基(批號：20110509)、DMEM-H培養基(批號：20110329)均購自北京Solaris公司。Ham’s F12培養基(美國GIBCO公司，批號：030M8309)。D/F12培養基：先將Ham’s F12培養基配制后，與DMEM-H以1∶1混勻，4 ℃備用；MTT(Sigma)工作液：使用時用PBS配制成5 mg·mL-1溶液，0.22 μm過濾，分裝，-20 ℃備用。

1.2 儀器

超凈工作臺(日本SANYO)；CO2培養箱(日本SANYO)，倒置顯微鏡(德國OLYMPUS)，低速離心機(上海飛鴿)，酶標儀(ThermoMultiskan MK3)。

1.3 動物

SPF級KM小鼠，雄性，18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(湘)2009-0004。

2 方法

2.1 白頭翁總皂苷及其化學成分體外抗腫瘤活性觀察

細胞購進后，用含10%胎牛血清的相應培養基在37 ℃、5% CO2條件下培養，其中人肝癌細胞SMMC-7721培養于RPMI 1640培養基；人結腸癌HT29培養于D/F12培養基。取對數生長期細胞，調整密度為8×104個·mL-1，接種于96孔板中，每孔100 μL，24 h后加入不同濃度含藥培養基100 μL，使藥物終質量濃度為3.125、6.25、12.5、25、50 μg·mL-1，每個濃度設3個平行孔，對照組每孔只加培養基100 μL，另設空白對照組，不加細胞只加培養基的作為對照凋零組。將96孔板置37 ℃、5% CO2培養箱培養48 h，每孔加入5 g·L-1MTT 20 μL，繼續培養4 h后，棄上清液，加入DMSO 150 μL，振蕩溶解10 min，酶標儀于490 nm處測定吸光度(A)值。棄上清液，每孔加DMSO 150 μL，振蕩混勻后用酶標儀在檢測波長為490 nm條件下測A值，按公式(1)計算細胞抑制率，采用改良的寇氏法計算半數有效抑制濃度(IC50)[17]。

(1)

2.2 白頭翁總皂苷及其化學成分體內抗腫瘤活性觀察

取傳代H22瘤株且生長良好的小鼠腹水，用0.9%氯化鈉溶液將腹水瘤細胞稀釋成2.5×106個·mL-1，每鼠0.2 mL接種于小鼠右側腋窩皮下，建立荷瘤小鼠模型。接種24 h后，將成功接種的KM小鼠隨機分為模型組，白頭翁總皂苷高、低劑量組(300、150 mg·kg-1)，B3、B7、B9、B11高、低劑量組(200、100 mg·kg-1)，環磷酰胺組(40 mg·kg-1)，共12組，模型組16只，其余每組12只，白頭翁總皂苷及其有效成分組每日按體質量灌胃給藥，給藥體積0.2 mL·(10 g)-1，模型組每日給予等量0.9%氯化鈉溶液，環磷酰胺隔日腹腔注射0.1 mL·(10 g)-1，連續14 d。末次給藥24 h后，將小鼠引頸處死，剝離腫瘤，分析天平稱質量，記錄瘤質量，按公式(2)計算抑瘤率(%)。取胸腺、脾臟，分析天平稱質量，記錄臟器質量，按公式(3)計算臟器指數。

(2)

臟器指數=臟器質量(mg)/體質量(10 g)

(3)

2.3 數據分析

3 結果

3.1 白頭翁總皂苷及其化學成分體外抗腫瘤作用研究

本研究主要觀察比較了白頭翁總皂苷及其主要活性成分B3、B7、B9、B11。這些主要成分都是由齊墩果酸皂苷為母核加上不同的糖組成(見圖1)。

實驗結果表明，白頭翁總皂苷、B3、B7、B9、B11均能較強地抑制體外人腫瘤細胞增殖，抑制率可高達100%，見表1、2。從半數有效抑制濃度(IC50)值來看，白頭翁總皂苷、B3、B7、B9、B11對SMMC-7721的IC50依次為(4.08±0.12)、(4.52±0.19)、(2.64±0.04)、(4.05±0.12)、(7.30±0.52)μg·mL-1，對HT-29的IC50依次為(3.22±0.06)、(4.28±0.16)、(2.57±0.10)、(3.29±0.11)、(5.39±0.26)μg·mL-1，均具有較好的體外抗腫瘤作用(見表3)，其中以B7對兩種細胞系均表現出較強的抑制作用(2.64、2.57 μg·mL-1)(F15，4=147.6，P<0.05)。比較B3和B7可見，23位的羥基化并不能提高相應的抑瘤活性。

3.2 白頭翁總皂苷及其化學成分體內抗腫瘤作用研究

為了進一步確證白頭翁總皂苷主要活性成分的抑瘤效應，我們又進行了小鼠荷瘤實驗。結果表明，白頭翁總皂苷的高、低劑量組，以及其他各活性成分的高劑量組瘤質量均明顯減小，與模型組相比，具有統計學差異(P<0.05，P<0.01)。各活性成分中，B7(62.1%)抑瘤活性仍然最強。其次為B3(57.7%)、B9(55.9%)和B11(49.2%)。白頭翁總皂苷表現出較好的抑瘤效應，高、低劑量組的抑瘤率分別為71.3%和61.8%。各組動物給藥后，體質量、胸腺指數及脾臟指數都有所下降，但各組間無統計學差異(見表4、5)。

圖1 白頭翁4種齊墩果酸皂苷成分結構

表1 白頭翁總皂苷及其化學成分對不同人肝癌SMMC-7721細胞的增殖影響

表2 白頭翁總皂苷及其化學成分對不同人結腸癌HT-29細胞的增殖的影響

表3 白頭翁總皂苷及各成分對SMMC-7721、HT-29細胞的

表4 白頭翁總皂苷及其化學成分對肝癌H22荷瘤小鼠瘤質量的影響及各組抑瘤率

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；下同。

表5 白頭翁總皂苷及其化學成分對肝癌H22荷瘤小鼠瘤質量的影響及各組抑瘤率

4 討論

本研究對白頭翁總皂苷及其4種主要成分進行了體內外抑瘤實驗觀察，結果表明，白頭翁總皂苷及其化學成分B3、B7、B9、B11對體內外瘤細胞均具有一定的抑制作用。體外抗腫瘤實驗中，對人肝癌SMMC-7721及人結腸癌HT-29的IC50值在5 μg·mL-1左右，4種單體成分與白頭翁總皂苷作用相當。體內對小鼠H22肝癌移植瘤模型的藥效實驗表明，B3、B7、B9、B11大劑量組(200 mg·kg-1)對小鼠H22肝癌均表現出明確的抑制作用，白頭翁總皂苷高(300 mg·kg-1)低(150 mg·kg-1)劑量均表現出明確的抑瘤作用。本實驗結果與文獻報道的基本一致[18-20]，因此，白頭翁皂苷的抗腫瘤作用是肯定的。

有研究表明，白頭翁皂苷中齊墩果酸皂苷對瘤細胞抑制作用強于羅烷型皂苷[21]。我們的實驗結果也表明了齊墩果酸皂苷對瘤細胞的抑制作用。白頭翁的4個主要成分均是以齊墩果酸皂苷為母核的衍生物。其中B3和B7所連接的糖一致，只是在碳23位有羥甲基的不同，B7在碳23位是甲基，B3在碳23位是羥甲基。B9和B11的母核基本同B7，只是在所連接的糖的排列順序及其數量不同。從實驗結果來看，B7在體內外抑瘤實驗中均表現出較強的抑瘤活性，提示這種抑瘤活性與所連接的糖的順序和數量有關，與碳23位的羥基化無明顯關系。B9由4個糖連接，比B11多2個糖，但是B9的抑瘤活性強于B11和B3，提示糖的數量對其抑瘤活性有一定的影響。體內抑瘤實驗結果與體外趨勢基本一致，最強的是B7，最弱的是B11。

值得注意的是，總皂苷的活性在整體動物實驗中表現出更強的抑瘤作用，其藥效強于各單一成分，但是在體外抑瘤實驗中，總皂苷并未表現出最強的活性。提示除了此4個成分外，總皂苷中可能還有其他的協同效應成分。同時也表明荷瘤小鼠的內環境對于藥物藥效的總體產生起到一定的促進作用，一些體外未表現出明顯活性的成分在體內微環境下可能會產生協同的效應[22-23]，如此尚有待于進一步研究。另外，本研究也提示白頭翁總皂苷作為一個復合物，其有效物質并不是某一成分，而是不同成分作用于不同靶點，產生協同或相加作用，體現了中藥多成分、多途徑、多靶點的作用特點[24]。中藥藥效物質基礎的研究是中藥現代化的主要內容之一，只有在藥效物質基礎明確的基礎上，才能有效地進行相關中藥有效部位的研究開發以及有效單體成分的研究開發，才能為研究高效低毒、成分明確、質量穩定的高水平中藥新藥奠定良好的基礎。本工作對于進一步深入認識白頭翁皂苷及其相關產品開發提供了實驗依據。

致謝：感謝清華大學生命科學學院杜力軍教授對本文提出的寶貴建議。