旋覆花總黃酮的降脂作用研究△

楊振，何麗明，倪賽宏，傅水蓮，鄒麗園，洪鐵*

(1.吉林農業(yè)大學 中藥材學院，吉林 長春 130118；2.吉林省中醫(yī)藥科學院，吉林 長春 130012；3.吉林大學 藥學院 藥理教研室，吉林 長春 031021，4.吉林大學 中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春 130033)

我國心腦血管疾病發(fā)病率逐年升高且日益年輕化。目前，心腦血管疾病已成為危害人群健康最嚴重的疾病[1]。流行病學研究顯示，我國約有2.9億人患心血管疾病，每小時約300人死于心腦血管疾病。高脂血癥作為心血管疾病的重要危險因素之一，其在動脈粥樣硬化和腦血管病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。預防和治療高脂血癥是防治心腦血管疾病的重要途徑[2]。目前，臨床上使用的降血脂藥物包括：用于促進膽酸或膽固醇排泄、促進膽固醇的降解、抑制膽酸和膽固醇吸收的膽酸螯合劑，如考來替泊、考來烯胺等；抑制膽固醇合成關鍵酶羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的HMG-CoA還原酶抑制劑類，如洛伐他汀、普伐他汀等；抑制cAMP的形成、導致甘油三酯酶活性降低、進而降低血液中甘油三酯濃度的煙酸及其衍生物，如阿西莫司、煙酸肌醇酯等。上述藥物雖能夠達到降血脂的作用，但長期服用均出現(xiàn)較嚴重的不良反應，因此，尋求療效顯著、安全可靠的調血脂的藥物得到廣泛關注[3-5]。

旋覆花是一種傳統(tǒng)的中草藥，為菊科旋覆花屬植物歐亞旋覆花的干燥頭狀花絮，主要分布于中國、韓國和日本，中國主要產于河南、河北、江蘇、浙江、新疆、東北等地[6]。該藥收載于《中華人民共和國藥典》2015年版一部，味咸、性溫，入肺、腎經，主治咳嗽消炎等。目前，已報道的旋覆花的化學成分約有40多種，主要含有甾醇、倍半萜、香豆素及黃酮類化合物，具有抗炎、抗肝損傷、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性。本研究采用高糖高脂飲食建立高脂血癥SD大鼠模型，初步探討旋覆花總黃酮對高脂血癥大鼠的降脂及改善脂肪肝作用[7-8]。

1 材料

1.1 動物

SD大鼠，雄性，150～160 g，SPF級，購于遼寧長生生物制品有限公司，許可證號：SCXK(遼)-2015-0001。動物飼養(yǎng)于吉林省中醫(yī)藥科學院的SPF屏障系統(tǒng)內，室內溫度(23±2)℃，相對濕度(50±10)%，晝夜明暗交替時間12/12 h，大鼠自由進食飲水。

1.2 試劑和藥品

旋覆花采自吉林省長春市雙陽區(qū)，標本存放于吉林省中醫(yī)藥科學院長白山資源所(編號：201700902)，經吉林省中醫(yī)藥科學院牛志多研究員鑒定為歐亞旋覆花InulabritannicaThunb.。

總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三脂(TG)試劑盒、總膽汁酸(TBA)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；血清白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；蘇木紫(Britain進口分裝)；曙紅(水溶，天津市大茂化學試劑廠)。

2 方法

2.1 旋覆花總黃酮的制備

取一定量旋覆花浸泡3 h后，過濾，濾渣用乙醇回流提取2次后過濾，合并濾液，濃縮。減壓干燥以獲得黃酮粗提取物。AB-8大孔樹脂純化歐亞旋覆花總黃酮的工藝條件為：提取物上樣濃度為0.2 g·mL-1，以2 mL·min-1的流速緩慢上樣，用70%乙醇進行洗脫，洗脫速度為3 mL·min-1，以高效液相法測定黃酮的含量，純化后總黃酮純度為86.54%。

2.2 動物分組

大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，將其隨機分為對照組，模型組，辛伐他丁陽性藥組(3.33 mg·kg-1)，旋覆花總黃酮高劑量組(100 mg·kg-1)、中劑量組(50 mg·kg-1)、低劑量組(25 mg·kg-1)，除空白組飼喂基礎飼料外，其余各組大鼠喂食高脂飼料(63.6%維持飼料、20%蔗糖、15%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉)建造高血脂癥模型，連續(xù)造模4周。第五周開始，繼續(xù)給予高糖高脂飼料的同時給予相應劑量的受試物干預，持續(xù)8周，每周測定1次體質量，根據(jù)體質量調整給藥劑量，每日早9時每籠(5只)給予400 g飼料，次日早9時收集飼料，稱體質量，計算每只大鼠的日均攝食量。

2.3 血清指標

實驗結束時，禁食12 h后，腹腔注射10%水合氯醛使大鼠麻醉，腹主動脈取血，室溫靜置30 min后，300×g，4 ℃，離心10 min，收集上清液，-80 ℃保存。按照試劑盒操作說明書測定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、SOD、MDA、GSH-PX、TNF-α、IL-6、IL-10水平。

2.4 肝臟指標

實驗結束后，迅速解剖大鼠，精確稱取大鼠相同部位肝臟0.2 g，在冰水中制成10%勻漿，4 ℃ 4000 r·min-1離心10 min，提取上清液，測定其中總膽固醇水平。取0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm塊狀的肝臟組織用預冷的0.9%氯化鈉溶液沖洗后擦干，快速置于中性福爾馬林溶液中固定。

2.5 糞便膽汁酸

于大鼠處死前12 h將大鼠分籠飼養(yǎng)，12 h后收集大鼠糞便，糞便經真空冷凍干燥后，用磷鉬酸比色法測定糞便中總膽汁酸的含量[9]。

2.6 肝臟病理形態(tài)學觀察

固定好的肝臟組織塊，依次用75%、95%和100%乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，H&E染色，于光學顯微鏡下病理學觀察每組切片中肝臟的脂肪變性、炎癥細胞及組織壞死程度。按照如下標準進行評分：+表示肝小葉結構尚存，肝組織結構大致正常，匯管區(qū)周圍肝細胞腫脹、輕度脂肪變性；++表示肝細胞排列紊亂，大部分肝細胞腫脹、氣球樣變，匯管區(qū)少量炎細胞浸潤；+++表示肝小葉結構輪廓消失，肝細胞形態(tài)不規(guī)則，可見部分肝細胞脂肪變性，也可見部分動物出現(xiàn)肝細胞點狀或片狀壞死，匯管區(qū)炎細胞浸潤。

2.7 統(tǒng)計方法

3 結果

3.1 對大鼠體質量及食量的影響

表1結果顯示，各劑量組大鼠進食量未存在統(tǒng)計學差異；與對照組相比，高脂血癥模型組大鼠體質量增長率顯著增加(P<0.05)，連續(xù)給予旋覆花總黃酮4周能夠顯著降低高脂血癥模型組大鼠體質量增長率(P<0.05，P<0.01)。

表1 對高血脂癥大鼠日均進食量及體質量增長率的影響

注：與對照組相比，##P<0.05；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；下同。

3.2 對高血脂癥大鼠血脂水平的影響

表2結果顯示，與對照組相比，高脂血癥模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平顯著增加，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)，連續(xù)給予旋覆花總黃酮4周能夠顯著降低高脂血癥模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平(P<0.05，P<0.01)。

3.3 對高血脂癥大鼠肝臟中膽固醇與糞便中膽汁酸水平的影響

表3結果顯示，與對照組相比，高脂血癥模型組大鼠肝臟中膽固醇水平顯著增加(P<0.05)，連續(xù)給予旋覆花總黃酮4周能夠顯著降低高脂血癥模型組大鼠肝臟中膽固醇水平(P<0.01)；與對照組相比，高脂血癥模型組大鼠糞便膽汁酸水平顯著增加(P<0.05)，連續(xù)給予旋覆花總黃酮4周能夠顯著增加高脂血癥模型組大鼠糞便中膽汁酸水平(P<0.05，P<0.01)。

3.4 對高血脂癥大鼠肝臟病理形態(tài)的影響

形態(tài)評分結果見表4，光鏡下H&E染色顯示，普通飲食組大鼠肝細胞排列整齊，肝小葉規(guī)則，細胞中央有大而圓的核，細胞質均勻(見圖1A)。高脂飲食組大鼠肝細胞腫脹，體積較正常明顯增大，出現(xiàn)脂肪變性，胞質內可見大小不等的脂滴空泡，以大泡性脂肪滴為主，匯管區(qū)有以單核、淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤，部分出現(xiàn)點狀壞死和灶狀壞死，大鼠出現(xiàn)散在性肝細胞脂肪變性(見圖1B)。給予旋覆花高、中、低劑量及辛伐他丁可改善肝臟的相關病理改變(見圖1C、D、E、F)。

3.5 對高血脂癥大鼠血清抗氧化活性的影響

表5結果顯示，與對照組相比，高脂血癥模型組大鼠血清中SOD活性顯著降低、MDA水平及GSH-PX活性顯著升高(P<0.05)；連續(xù)給予旋覆花總黃酮4周能夠顯著升高高脂血癥模型組大鼠血清中SOD活性，降低MDA水平及GSH-PX活性(P<0.05，P<0.01)。

3.6 對高血脂癥大鼠血清炎癥因子的影響

表6結果顯示，與對照組相比，高脂血癥模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平顯著升高，IL-10水平顯著降低(P<0.05)；連續(xù)給予旋覆花總黃酮4周能夠顯著降低高脂血癥模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平，升高IL-10水平(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。

表2 對高脂血癥模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平的影響 mmol·L-1

表3 對高脂血癥大鼠肝臟中膽固醇及糞便中膽汁酸水平的影響

表4 對模型組大鼠肝臟病理形態(tài)的影響

注：A.普通飲食組；B.高脂飲食組；C.高脂飲食+辛伐他丁組；D.高脂飲食+旋覆花低劑量組；E.高脂飲食+旋覆花中劑量組；F.高脂飲食+旋覆花高劑量組。圖1 各組大鼠肝臟組織HE染色結果(HE×200)

表5 對高脂血癥模型組大鼠血清中SOD、MDA、GSH-PX水平的影響

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

表6 對高脂血癥模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10水平的影響

4 討論與結論

高脂血癥作為由機體內脂質代謝紊亂引發(fā)的血漿中脂質濃度升高的疾病，其臨床表現(xiàn)為體質量增加，血清TC、TG以及LDL-C水平過高，HDL-C水平過低[10]。本研究表明，經口給予旋覆花總黃酮能夠在不影響大鼠進食量的情況下抑制體質量增加，同時降低高血脂癥模型大鼠肝臟中膽固醇水平、糞便中膽汁酸水平、血清中TC、TG及LDL-C水平，提高HDL-C水平，具有改善高脂血癥臨床癥狀。

膽固醇在肝中不斷代謝為膽汁酸，其隨膽汁排入腸腔，參與脂肪的消化與吸收。隨后約95%膽汁酸再經小腸被重吸收，形成“肝腸循環(huán)”而重復利用。本研究結果顯示，旋覆花總黃酮能夠促進膽汁酸排泄，進而阻止機體對于膽汁酸的吸收，以抑制肝腸循環(huán)，進而達到降低肝臟中膽固醇的效果。

同時，實驗探究了旋覆花總黃酮對高血脂癥大鼠血清相關指標的影響。結果顯示，高血脂癥大鼠血清中脂質過氧化反應總產物MDA水平增加，而抗氧化酶GSH-PX和SOD活性極顯著下降，表明高脂血癥大鼠脂質過氧化水平增加和自由基清除能力下降。經口給予旋覆花總黃酮后，大鼠血清中的GSH-PX和SOD活性均顯著提高，MDA含量顯著降低，即旋覆花總黃酮可能通過提高機體抗氧化活性，降低體內自由基的水平，改善高脂血癥大鼠體內氧化-抗氧化失衡狀態(tài)。

在高血壓、高血脂癥、動脈粥樣硬化患者血漿中，炎癥因子水平發(fā)生明顯變化，其由脂肪組織分泌產生，參與炎癥反應，且在脂肪分解代謝中發(fā)揮作用。促炎及抗炎因子的失衡可導致脂肪肝，研究顯示，高血脂癥大鼠的血清中TNF-α、IL-6水平顯著升高，IL-10水平顯著降低，經口給予旋覆花總黃酮后，大鼠血清中TNF-α、IL-6水平顯著降低，IL-10水平顯著升高，其能夠緩解高脂血癥低度炎癥狀態(tài)。

有大量的研究報道，中藥黃酮類具有改善脂肪肝的作用，如山楂總黃酮、甘草總黃酮、大豆異黃酮等[11-14]。但其改善脂肪肝的機制也存在著不同，如山楂總黃酮、大豆異黃酮主要作用機制是抗氧化作用[11-12]，甘草總黃酮是通過激活AMPK信號分子改善脂肪肝[13]。而本研究表明旋覆花總黃酮的作用機制是多方面的，除抗氧化作用外，具有促進膽汁酸排泄及抑制炎癥的作用，進而發(fā)揮降血脂及改善脂肪肝的作用，這也為旋覆花治療脂肪肝奠定了理論基礎。