薄層色譜掃描法測定桑白皮中桑辛素含量△

劉一涵，田云剛，王建霞，向芳芳，魏華，2*

(1.吉首大學 生物資源與環境科學學院，湖南 吉首 416000；2.湖南省土家醫藥研究中心，湖南 吉首 416000)

桑白皮(Mori Cortex)為桑科植物桑MorusalbaL.的干燥根皮，最早記載于《神農本草經》，現為《中華人民共和國藥典》2015版收載的常用中藥，具有瀉肺平喘，利水消腫之功效，主要治療肺熱喘咳，水腫脹滿尿少，面目肌膚浮腫[1]。化學成分研究表明，桑白皮中含有Diels-Alder型加合物、黃酮類、二苯乙烯類、2-芳基苯并呋喃類、多羥基生物堿類及其他類的多種化學成分。藥理研究表明，桑白皮具有降血壓、降血脂、降血糖、鎮痛、抗癌、抗HIV、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗微生物等多種藥理作用[2-3]。桑辛素(morusin)，也稱桑根皮素，是從桑白皮中分離出的一種異戊烯類黃酮，具有抗腫瘤、抗炎[4]、抗氧化、降糖[5]、降血脂[6]、鎮痛[7]、抗痙攣[8]、抑膽堿脂酶[9]及其他[10]等多方面的藥理活性，是極具開發價值的藥物先導化合物和桑白皮中可能的主要指標性成分。近年來，對于桑辛素的含量測定已有部分報道[11-14]，但這些方法中有的代價較大、有的步驟繁瑣、有的耗時耗力。因此，為了克服前人分析方法的不足，有必要采用一種靈敏、高效和低廉的分析方法。本研究采用簡單、易行的雙波長薄層色譜掃描法對不同產地桑白皮中桑辛素的含量進行測定，一方面為桑白皮中桑辛素的質量控制提供了一種新的參考方法，另一方面為桑白皮的綜合利用提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CAMAG SCANNER 3型薄層掃描儀(瑞士卡瑪公司)，CAMAG SANMPLER 4型全自動點樣儀(瑞士卡瑪公司)，CAMAG ADC2自動展開缸(瑞士卡瑪公司)，25 μL進樣針(瑞士卡瑪公司)，AG285電子天平(瑞士METTLER TOLEDO)，不同規格硅膠GF254預制板(青島海洋化工廠)，LD-4臺式離心機(常州天瑞儀器有限公司)，KQ-250DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，BZF 50型真空干燥箱(Boxun)。

1.2 材料

桑辛素對照品自制(純度達98%以上)。桑白皮藥材購買或采集，經吉首大學魏華副教授鑒定為桑科植物桑MorusalbaL.的干燥根皮，藥材產地見表1。試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱定10.0 mg桑辛素對照品，加甲醇溶解并定容至10 mL，制成濃度為1 mg·mL-1的溶液，取1 mg·mL溶液1 mL再定容至10 mL，稀釋為0.1 mg·mL-1，即為對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取桑白皮樣品粉末(過60目篩)0.5 g，精密稱定，加甲醇，料液比為1∶10，超聲波輔助提取30 min，4000 r·min-1離心10min取上清液，此法提取四次，合并上清液、濃縮，甲醇溶解并定容至5 mL，微孔濾膜(0.45 μm)濾過，濾液備用。

2.3 薄層色譜分離、掃描條件

點樣條件：取0.1 mg·mL-1對照品溶液和供試品溶液3 μL于GF254薄層板上條帶點樣，點樣速度：150 nL·s-1，樣點寬度：6 mm，點樣基線距底邊10 mm，樣點距邊緣20 mm，樣點間距為10.6 mm。

層析條件：以石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(1.5∶0.8∶1)為展開劑，溫度為(25±3) ℃，濕度為50%～55%，展開槽內放飽和濾紙飽和30 min，上行展開，展至約9 cm處。取出晾干后置于UV254 nm下檢視，供試品色譜中含有與對照品相應的暗斑，且與其他組分完全分離，可進行定量分析(圖1)。

注：R表示桑辛素對照品，1～10樣品信息見表1。圖1 桑辛素對照品及10批樣品薄層色譜圖(254 nm)

掃描條件：將層析后的對照品和供試品在200～700 nm范圍內掃描，結果二者均在273 nm處有最大吸收(圖2)，故選擇掃描波長為λS=273 nm，λR=500 nm，狹縫：0.4 mm×0.2 mm，掃描速度：20 mm·s-1，反射式鋸齒形掃描。以斑點峰面積隨行外標二點法計算含量(圖3)。

2.4 精密度試驗

同板精密度：取低濃度對照品在同一硅膠板上平行點樣6個點，每點均為3 μL，依法展開，晾干，掃描，測得桑辛素含量RSD為1.21%(n=6)，結果表明，同板精密度良好。

表1 10批藥材中桑辛素含量測定結果(n=4)

圖2 薄層掃描色譜圖

圖3 對照品及10批樣品薄層掃描3D圖譜

異板精密度：取低濃度對照品溶液于不同薄層板上各點樣3 μL，依法展開，測得桑辛素含量RSD為2.30%(n=6)，結果表明，異板精密度良好。

2.5 檢測限和定量限實驗

精密吸取對照品適量，在同一薄層板上分別點0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μL，每個點平行3次，依法展開、掃描，進行檢測限與定量限測定。分別以信噪比(S /N)為3時和信噪比(S/N)為10時的點樣作為檢測限和定量限。結果桑辛素的檢測限為20 ng，定量限為40 ng。

2.6 線性關系考察

用全自動點樣儀點0.1 mg·mL-1對照品溶液2.0、2.5、4.0、6.0、8.0、10.0、10.5、11.0 μL于同一硅膠GF254薄層板上，按上述薄層色譜條件展開，掃描測定，以斑點峰面積積分值Y為縱坐標，對照品點樣量X(ng)為橫坐標計算桑辛素含量的回歸方程：Y=5 814.491+40.320X，r=0.999 1，sdv=2.04%。結果表明，桑辛素點樣量在200～1100 ng范圍內與峰面積呈良好的線性關系，如圖4。

圖4 桑辛素的標準曲線圖

2.7 穩定性試驗

在同一GF254硅膠板上交叉點供試品和對照品，展開，每隔20 min掃描一次，持續2 h，結果表明，桑辛素斑點峰面積值至少在2 h內基本保持不變，RSD=2.10%(n=7)，穩定性良好。

2.8 重復性試驗

精密稱取2號藥材5份，各0.5 g，按2.2項供試品溶液制備方法制備，各溶液點樣、展開、掃描，測得桑辛素含量RSD為2.80%，表明重復性良好。

2.9 加樣回收率實驗

精密稱定已知含量的藥材5份，各0.25 g，精密加入1 mg·mL-1對照品溶液適量，按2.2項下供試品處理方法操作，得回收率供試品，依法測定含量，并計算回收率。結果見表2。

表2 加樣回收率測定結果

2.10 樣品含量測定

按2.2項下的方法制備10批桑白皮藥材的供試溶液，用全自動點樣儀交叉點樣對照品和供試品溶液適量，按2.3項下方法展開、晾干、掃描測定10批桑白皮藥材中桑辛素的含量。結果見表2。10批樣品中桑辛素含量在0.737～1.599 mg·g-1范圍內，其中四川綿陽野生樣品中桑辛素含量最高，云南栽培樣品中桑辛素含量其次，桑辛素含量最高與最低的樣品相差超過2倍。

3 討論

目前，《中華人民共和國藥典》2015版中所記載的桑白皮無規定的含量測定指標性成分[1]，而桑辛素具有多種重要的藥理作用，且其含量較為可觀，因此，有望成為桑白皮中指標性成分之一。已有報道的關于桑白皮中桑辛素含量的測定方法主要有HPLC、UPLC和紫外分光光度法。其中，HPLC和UPLC精密度高，但流動相選擇范圍較窄，每次只能測定一個樣品且分析耗時較長，數據處理較慢；紫外分光光度法操作較為繁瑣，耗時長，對其他干擾較為敏感。

本研究采用薄層色譜掃描法測定的桑辛素，其在UV254 nm下可見清晰暗斑，故點樣于GF254薄層板上無需顯色，可直接定性觀察和定量掃描。在耗時約半小時，于20 cm×10 cm薄層板上可一次性成功分離、鑒別和測定18個不同樣品中的桑辛素，且試驗中使用全自動點樣儀點樣，能很好控制點樣量，減小實驗誤差。與其他方法相比較，薄層掃描法可在同一薄層板上同時分離、分析多個樣品；靈敏度高，適于分析小量樣品；流動相用量少且選擇范圍寬、方便更換；固定相為一次性使用，對樣品的預處理要求低；軟件自帶數據處理，結果準確、快速。因此，本方法是一種簡單、快速和廉價的方法，是HPLC法、UPLC法的重要補充。適合于桑辛素的常規分析，可作為桑白皮中桑辛素含量控制的新的參考方法。