經(jīng)導(dǎo)管局部灌注紫杉醇模擬藥物涂層球囊預(yù)防小型豬髂總靜脈狹窄的實驗研究

魯景元，徐文健，施萬印，顧建平*

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院(南京市婦幼保健院)介入科，南京 210004； 2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院介入科，南京 210006)

藥物涂層球囊(drug-coated balloon，DCB)最早用于治療冠狀動脈狹窄性病變[1]，此后逐步向外周動脈狹窄性病變的治療中推廣[2]，國外近期有將DCB應(yīng)用于肺靜脈狹窄[3]及中心靜脈狹窄[4]治療的報道，但將DCB用于外周靜脈狹窄性病變治療的動物實驗及臨床研究罕見。參閱相關(guān)文獻(xiàn)[5-9]，本研究采用“雙球囊封堵注藥”的方法模擬DCB的作用，并通過動物實驗探討DCB對于外周靜脈狹窄性病變的治療價值，在目前具有一定的創(chuàng)新性和現(xiàn)實意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

取6 ～ 8月齡、體重16 ～ 20 kg的雄性普通級實驗用巴馬小型豬20頭，隨機(jī)分入實驗組(n=10)和對照組(n=10)。實驗前兩組均禁食12 h，禁飲4 h。實驗動物由上海市浦東新區(qū)老港鎮(zhèn)華新特種養(yǎng)殖場實驗豬繁育與實驗研究基地提供[SCXK (滬) 2012-0013]。實驗用巴馬小型豬飼養(yǎng)于普通級半開放式豬舍[SYXK (蘇) 2016-0006]。本實驗經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審批編號[201607-029]。本實驗全過程中，充分尊重“動物福利”，以動物實驗的“3R原則”為指導(dǎo)，最大限度地給予實驗動物人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

氯胺酮、戊乙奎醚、丙泊酚、碘佛醇、碘普羅胺、紫杉醇注射液、注射用頭孢拉定等。醫(yī)用血管造影X射線機(jī)：Artis Zee，Siemens公司；血管鞘組、超滑導(dǎo)絲、交換導(dǎo)絲、血管內(nèi)造影導(dǎo)管，Terumo公司；球囊擴(kuò)張導(dǎo)管：Cordis PowerflexTMP3(6 mm、8 mm)，Johnson & Johnson公司；壓力泵：EncoreTM26 Inflator，Boston Scientific公司；徠卡切片及組織包埋系統(tǒng)；Gudien(固迪安)大動物尸體解剖臺。

1.3 實驗方法

1.3.1 麻醉和建模

氯胺酮8 mg/kg +戊乙奎醚0.02 mg/kg頸后肌內(nèi)注射，同時給予流量5 L/min面罩吸氧，并經(jīng)耳緣靜脈持續(xù)泵入氯胺酮5 mg/(kg·h) +丙泊酚5 mg/(kg·h)維持麻醉。麻醉滿意后選擇1.3∶1的過大球囊[10]擴(kuò)張擬處理段髂總靜脈，造成靜脈內(nèi)、中膜機(jī)械性損傷。

1.3.2 模擬藥物涂層球囊

實驗組小型豬，撤出建模用球囊導(dǎo)管后，經(jīng)股靜脈鞘在導(dǎo)絲引導(dǎo)下置入一枚球囊導(dǎo)管(球囊1)，使球囊1頭端位于之前處理段靜脈遠(yuǎn)心端。之后，行經(jīng)皮頸靜脈穿刺或頸靜脈切開穿刺(經(jīng)皮穿刺困難時)，置入5F血管鞘。經(jīng)導(dǎo)絲引導(dǎo)，置入另一枚球囊導(dǎo)管(球囊2)，球囊2頭端位于處理段靜脈近心端。遠(yuǎn)心端及近心端球囊直徑選擇與該處所測量靜脈內(nèi)徑相等或略大(1∶1 ～ 1.1∶1)，該兩處球囊起封堵靜脈血流，延長紫杉醇與處理段血管壁作用時間的作用。壓力泵分別充盈球囊1及球囊2，并經(jīng)球囊1導(dǎo)管腔在透視下緩慢推注紫杉醇與碘普羅胺的混合溶液，紫杉醇的濃度約為4 mg/mL，推注持續(xù)時間為120 s。模式圖及X線造影圖像，見圖1、圖2。推注結(jié)束后，依次排空并撤出球囊1及球囊2，并拔出股靜脈及頸靜脈鞘管。對照組不行以上操作。

圖1 經(jīng)導(dǎo)管向小型豬髂總靜脈局部灌注紫杉醇模擬DCB模式圖Figure 1 Pattern diagrams of simulated drug-coated balloons with local perfusion of paclitaxel into the common iliac vein of miniature pigs

圖2 經(jīng)導(dǎo)管向小型豬髂總靜脈局部灌注紫杉醇模擬DCB靜脈造影圖像Figure 2 Venography image of simulated drug-coated balloons with local perfusion of paclitaxel into the common iliac vein of miniature pigs

1.3.3 小型豬術(shù)后管理

小型豬麻醉復(fù)蘇后，送回動物實驗中心，兩組均給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，同時予10 mg/kg劑量的頭孢拉定注射液行臀大肌注射，連用3 d。每日喂食兩次，日投喂量為體重的2%，清潔水飲用無限制。實驗組和對照組小型豬術(shù)前、術(shù)后2周抽取靜脈血標(biāo)本(抽血前禁食12 h)評估肝腎功能變化；術(shù)前及術(shù)后2月行髂總靜脈X線造影檢查，觀察髂總靜脈管腔狹窄情況并測量其內(nèi)徑；術(shù)后2月造影檢查后，空氣栓塞處死小型豬，解剖分離髂總靜脈標(biāo)本，HE染色后，鏡下觀察處理段髂總靜脈管壁病理學(xué)改變。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小型豬一般情況

20頭小型豬中，1頭麻醉過程中死亡，1頭建模操作過程中死亡，1頭死于術(shù)后飼養(yǎng)過程中，其余17頭均存活至實驗終點。實驗組(n=9)對比對照組(n=8)，體重[(17.7±1.17) kg vs. (17.4±1.40) kg，P=0.631]、月齡[(7.16±0.40)月vs. (7.14±0.39)月，P=0.933]。兩組體重及月齡差異均無顯著性(P> 0.05)。

2.2 小型豬肝腎功能指標(biāo)變化

實驗組術(shù)前對比術(shù)后2周、實驗組術(shù)后2周對比對照組術(shù)后2周，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、肌酐(creatinine，Cr)及血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)差異均無顯著性(P> 0.05)。見表1、表2。

表1 實驗組術(shù)前與術(shù)后2周肝腎功能指標(biāo)對比Table 1 Comparison of liver and kidney function indices in the experimental group between preoperative and 2 weeks after operation

注：術(shù)后2周與術(shù)前對比，P> 0.05。

Note. Two weeks after operation compared with preoperative,P> 0.05.

表2 實驗組與對照組術(shù)后2周肝腎功能指標(biāo)對比Table 2 Comparison of liver and kidney function indices between the experimental group and control group at 2 weeks after operation

注：實驗組與對照組對比，P> 0.05。

Note. The experimental group compared with the control group,P> 0.05.

注：A：術(shù)前小型豬髂總靜脈X線造影，管腔內(nèi)壁光整；B：術(shù)后2月小型豬髂總靜脈X線造影，管腔輕度狹窄(< 30%)，管壁稍毛糙；C：術(shù)后2月小型豬髂總靜脈X線造影，管腔中度狹窄(≥ 30%，< 70%)；D：術(shù)后2月小型豬髂總靜脈X線造影，管腔重度狹窄(≥ 70%)。圖3 髂總靜脈造影圖像Note. A: X-ray radiography of the common iliac vein in miniature pigs before operation showed smooth vascular cavity inner walls. B: X-ray radiography of the common iliac vein in miniature pigs two weeks after operation showed narrowing of the lumen (< 30%) and slight hardening of the vascular wall. C: X-ray radiography of the common iliac vein in miniature pigs two weeks after operation showed moderate narrowing of the lumen (≥ 30%, < 70%). D: X-ray radiography of the common iliac vein in miniature pigs two weeks after operation showed severe narrowing of the lumen (≥ 70%).Figure 3 Venography image of common iliac vein

2.3 小型豬髂總靜脈管腔內(nèi)徑變化

小型豬術(shù)前及術(shù)后2月髂總靜脈造影圖像，見圖3。

實驗組術(shù)前對比實驗組術(shù)后2月管腔內(nèi)徑[(5.08±0.43) mm vs. (3.74±1.24) mm，P< 0.05]；對照組術(shù)前對比對照組術(shù)后2月管腔內(nèi)徑[(5.07±0.72) mm vs. (2.25±1.41) mm，P< 0.05]，兩組術(shù)后管腔內(nèi)徑均較術(shù)前減少，說明建模是成功的。術(shù)前實驗組對比對照組管腔內(nèi)徑[(5.08±0.43) mm vs. (5.07±0.72) mm，P> 0.05]；術(shù)后2月實驗組對比對照組管腔內(nèi)徑[(3.74±1.24) mm vs. (2.25±1.41) mm，P< 0.05]，術(shù)前兩組管腔內(nèi)徑無明顯差別，而術(shù)后2月對照組管腔較實驗組狹窄，說明模擬DCB能夠延阻靜脈管腔狹窄的進(jìn)展。見表3。

表3 實驗組與對照組術(shù)前、術(shù)后2月處理段管腔內(nèi)徑對比Table 3 Comparison of lumen diameter of the target vein in the experimental group and control group at preoperative and 2 weeks after operation

注：術(shù)后2周與術(shù)前對比，*P< 0.05；實驗組與對照組對比，△P< 0.05。

Note. Two weeks after operation compared with preoperative,*P< 0.05. The experimental group compared with the control group,△P< 0.05.

2.4 小型豬髂總靜脈管壁組織病理變化

術(shù)后2月，實驗組與對照組小型豬在完成造影檢查后，空氣栓塞法處死，解剖分離處理段及對側(cè)相同部位未處理髂總靜脈標(biāo)本(空白對比)。經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片及HE染色后，100倍、200倍光學(xué)顯微鏡下觀察并照相。光鏡下見：實驗組與對照組小型豬髂總靜脈管壁在過大球囊擴(kuò)張后2月，內(nèi)彈力膜均顯示不清，內(nèi)膜、中膜界限模糊；與對側(cè)相同部位未處理髂總靜脈相比，實驗組與對照組處理段髂總靜脈內(nèi)膜、中膜均增厚，且對照組增厚更明顯；對照組處理段髂總靜脈內(nèi)、中膜的平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)數(shù)量和體積明顯多于實驗組，且細(xì)胞排列紊亂；實驗組與對照組外彈力膜均殘缺不完整，且對比差別不大。實驗組與對照組術(shù)后2月，小型豬髂總靜脈病理改變，見圖4。

注：A：對側(cè)髂總靜脈(× 200)，內(nèi)、中膜完整，界限清晰；B：對照組髂總靜脈(× 200)，內(nèi)、中膜增厚，中膜VSMCs增多紊亂；C：實驗組髂總靜脈(× 100)，內(nèi)、中膜輕度增厚；D：對照組髂總靜脈(× 100)，內(nèi)、中膜增厚伴大量淋巴細(xì)胞浸潤。圖4 小型豬髂總靜脈病理改變(HE染色)Note. A: In the contralateral common iliac vein, the internal and middle membranes were intact with clear boundaries (× 200). B: In the common iliac vein of the control group, the internal and middle membranes were thickened with increased VSMCs in the middle membrane (× 200). C: In the common iliac vein of the experimental group, the inner and middle membranes were slightly thickened (× 100). D: In the common iliac vein of the control group, the internal and middle membranes were thickened with considerable lymphocytic infiltration (× 100).Figure 4 Histological changes of common iliac vein of the miniature pigs. HE staining

3 討論

狹窄性病變不僅存在于外周動脈疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中，其與外周靜脈疾病進(jìn)程亦密切相關(guān)。髂靜脈[11]、鎖骨下靜脈[12]、移植器官靜脈[13]、透析道靜脈[14]等的原發(fā)及治療后再狹窄發(fā)生率并不低。然而，目前針對外周靜脈狹窄發(fā)生機(jī)制的研究遠(yuǎn)不如針對外周動脈的研究深入。

利用過大球囊擴(kuò)張小型豬髂總靜脈，造成靜脈管壁的機(jī)械性損傷，而損傷修復(fù)過程是形成靜脈管腔狹窄的病理基礎(chǔ)。本研究實驗結(jié)果表明，利用這一原理構(gòu)建小型豬髂總靜脈狹窄模型是切實可行的。

本實驗開始實施時，國內(nèi)尚未有用于外周的DCB產(chǎn)品上市，而用于冠狀動脈的DCB直徑又不能滿足實驗需要。所以該實驗設(shè)計為：采用兩枚球囊分別封堵目標(biāo)段靜脈近心端和遠(yuǎn)心端后，再向封閉段靜脈管腔內(nèi)注入紫杉醇與碘普羅胺混合液，以此延長活性藥物與管壁接觸時間來模擬DCB的作用。實驗結(jié)果證明，這樣的實驗設(shè)計，在操作上完全可行；在效果上達(dá)到了實驗預(yù)期，在2個月觀察期內(nèi)有效地減輕了小型豬髂總靜脈狹窄程度；在安全性上，對小型豬肝、腎功能指標(biāo)無明顯影響，且在整個實驗過程中未觀察到其他相關(guān)不良事件。

本實驗通過模擬DCB的作用，對小型豬髂總靜脈狹窄模型處理段管壁組織的病理轉(zhuǎn)歸過程產(chǎn)生了正面干預(yù)：與對照組相比，實驗組小型豬髂總靜脈管壁內(nèi)VSMCs在紫杉醇的作用下增殖、遷移和分泌受到明顯抑制，減輕了靜脈內(nèi)膜、中膜增生程度，從病理機(jī)制上降低了靜脈再狹窄的發(fā)生。

實驗中存在不足及有待改進(jìn)之處：在臨床上，靜脈狹窄常見于：髂靜脈狹窄、鎖骨下靜脈狹窄、血液透析道狹窄、TIPS術(shù)后分流道狹窄、Budd-Chiari綜合征、器官移植后靜脈吻合口狹窄等。多數(shù)靜脈狹窄性病變的形成為慢性、漸進(jìn)性過程，本實驗以急性機(jī)械損傷的方法建立小型豬髂總靜脈狹窄模型，與實際病變的發(fā)生、發(fā)展可能存在一定差別。在后續(xù)實驗改進(jìn)中，通過適當(dāng)?shù)姆椒ń㈧o脈慢性狹窄的動物模型用于研究，可能更加貼近臨床實際。此外，本研究通過一定的實驗設(shè)計，利用“雙球囊封堵注藥法”來模擬DCB對靜脈管壁的作用，并不是直接使用DCB進(jìn)行實驗。“雙球囊封堵”操作步驟繁瑣，小型豬頸靜脈穿刺困難，常需切開暴露穿刺，增加了手術(shù)時間及術(shù)后感染風(fēng)險。目前用于外周的DCB產(chǎn)品已在國內(nèi)上市，后續(xù)實驗中可直接使用DCB，以獲得更為準(zhǔn)確的實驗數(shù)據(jù)。本實驗還存在樣本量較小、隨訪時間較短的不足。在后續(xù)的研究中，應(yīng)增加樣本數(shù)量、延長隨訪時間，在靜脈狹窄的模型上進(jìn)一步驗證DCB對靜脈狹窄性病變的有效性及安全性，使實驗結(jié)果更具說服力，對臨床治療有更高的指導(dǎo)價值。