局部腦缺血再灌注損傷對小鼠TMEM166基因和神經細胞自噬的影響

王 瑜，王天龍，趙 磊，李 麗

(首都醫科大學宣武醫院麻醉科，北京 100053)

TMEM166(transmembrane protein 166，也稱為FLJ13391)基因定位于人2號染色體短臂12區(2p12)，其進化較保守，是目前通過高通量功能篩選出的一個明顯下調內參活性同時誘導細胞死亡的新基因。研究發現，過表達TMEM166可以抑制HeLa細胞的克隆形成能力，最終引起HeLa細胞的自噬性死亡[1]。TMEM166基因相對分子量約17 450，表達產物由152個氨基酸組成，在人體多種組織廣泛表達，與細胞自噬密切相關[2]。LC3-II是自噬體的標志分子，是由LC3前體在蛋白水解酶的作用下剪切C末端形成的LC3-I經泛素樣加工與磷脂酰乙醇胺(PE)結合而形成，能靶向定位于自噬體膜，參與自噬的形成[3]。本研究擬在腦缺血再灌注損傷模型上觀察TMEM166的表達變化，探討其與腦缺血損傷后神經細胞自噬之間的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級9 ～ 10周齡C57/BL6J雄性小鼠50只，體重22 ～ 28 g，由首都醫科大學實驗動物科學部提供[SCXK (京) 2016-0006]。動物飼養于屏障系統飼養設備，溫度20℃ ～ 26℃，濕度40% ～ 70%，光照12 h亮12 h暗[SYXK (京) 2016-0010]。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉購自廣州萊綠寵商貿有限公司；小鼠抗TMEM166抗體(sc-162329)、兔抗LC3-II抗體(sc-400714)購自美國Santa Cruz公司；ABC過氧化物酶試劑盒，抗小鼠、抗兔ABC過氧化物酶試劑盒購自上海魯汶生物科技有限公司；DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Western blot相關試劑購自美國Bio-Rad公司。Olympus BX51光學顯微鏡購自奧林巴斯(中國)有限公司；X膠片、Gel Doc XR+凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與模型建立

C57/BL6J雄性小鼠50只隨機分為缺血90 min再灌6，12，24及48 h組，每組12只。動物用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定后做頸部正中切口，保持頭后仰，呼吸道通暢，鈍性分離右側頸總動脈及其上行頸外動脈、頸內動脈及翼腭動脈分支。動脈夾暫時夾閉頸總動脈，縫線結扎翼腭動脈，并分別于頸外動脈近心端、遠心端底部留置縫線，將其遠心端打結系緊，近心端系一個松結備用，隨后在頸外動脈的兩縫線間用血管剪一個小口，將一5.0自制硅膠線栓送入頸內動脈，深度約10 mm，之后將近心端絲線拉緊以防血液反流滲出，用濕潤的紗布覆蓋手術切口，并注意保暖，密切觀察其變化。栓塞1.5 h后拔除線栓，依次縫合切口。術中監測體溫、血壓、呼吸等各項生命體征，用電熱毯保持體溫在(37±0.5)℃左右，手術結束動物蘇醒后出現左側前肢偏癱的實驗動物進入下一步實驗。實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.3.2 神經功能評分

采用Garcia神經功能評分標準[4]用雙盲法于再灌注后各時間點對實驗動物進行評分，最低評分3分，最高評分18分，得分越低提示神經功能損傷越嚴重。

1.3.3 免疫組化染色

各組動物按再灌注時間深麻醉后迅速剪開胸骨暴露心臟，20 mL注射器針頭小心刺入左心室，并剪開右心耳，于左心室快速灌注預冷的生理鹽直至從右心耳流出的血液顏色變淺，隨后再以冷的4%多聚甲醛先快后慢灌注，待充分固定后取全腦放入30%蔗糖，4℃冰箱保存至沉底。OTC包埋后做連續冠狀冰凍切片，切片厚10 μm，風干后4℃保存。鹽酸抗原修復30 min，充分浸洗；3%雙氧水消除內源性過氧化物酶活性10 min(避光)，洗滌后置于牛血清封閉30 min，吸除血清后添加一抗孵育液4℃過夜，陰性對照組用PBS替代，抗體稀釋濃度分別為：小鼠抗TMEM166 1∶200，兔抗LC3-II 1∶500。充分浸洗后按照ABC過氧化物酶試劑盒，抗小鼠、抗兔ABC過氧化物酶試劑盒的說明書進行二抗、三抗的孵育，最后DAB顯色并封片。Olympus BX51顯微鏡20×下觀察缺血側大腦皮層及基底核區，光鏡下棕染有細胞形態的為陽性細胞。

1.3.4 Western blot分析

留取各時間點小鼠缺血側大腦皮層及基底核區的新鮮樣本，根據蛋白濃度測定結果，取相同總量蛋白，沸水浴變性10 min。配分離膠(8%/10%/12%，根據分子量大小不同選擇不同濃度的膠)，及4%的濃縮膠，待其聚合后上樣，每個泳道50 μg，設置電壓45 V開始電泳，當溴酚藍過上層膠后升高電壓至100 V，根據分子量大小適時停止電泳啟動電泳。電泳完畢后，關閉電源，取出凝膠，放入電轉液中漂洗，按順序正確安裝電轉槽，倒入預冷的電轉液，電轉結束后，取下硝酸纖維素膜，置入5%脫脂奶粉封閉液室溫2 h。1× TBST漂洗后加入一抗4℃過夜，抗體稀釋濃度分別為：小鼠抗TMEM166 1∶1000，兔抗LC3-II 1∶800。復溫30 min，緩沖液沖洗3遍加入二抗，室溫孵育1 h。按比例配制發光液，室溫下避光孵育5 min。暗室下曝光顯影。X膠片曝光后經凝膠成像系統分析數據。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 模型的選擇

選取手術結束動物蘇醒后出現左側前肢偏癱評分為6 ～ 11分的實驗動物進入下一步實驗，實驗中有1只動物因損傷太重死亡，1只因評分太高均被排除。

表1 再灌注后不同時間點的神經功能評分Table 1 Neurological scores at different time points after reperfusion

2.2 免疫組化染色

TMEM166及LC3-II的棕黃色陽性細胞在再灌注6 h時已經有表達[(60±2)，(60±2)]，陽性細胞的數目在12 h時進一步增加[(84±2)，(86±2)]，24 h達到高峰[(123±2)，(122±2)，P< 0.05]，48 h后開始下降[(87±2)，(85±2)]，見圖1、圖2。

注：與6 h比較，*P < 0.05；與12 h比較，#P < 0.05；與24 h比較，& P < 0.05。圖1 再灌注后TMEM166在不同時間點的陽性細胞數目Note. Compared to 6 h, * P < 0.05. Compared to 12 h,#P < 0.05. Compared to 24 h, & P < 0.05.Figure 1 TMEM166 positive cell number at different time points after reperfusion

注：與6 h比較，*P < 0.05；與12 h比較，#P < 0.05；與24 h比較，& P < 0.05。圖2 再灌注后LC3-II在不同時間點的陽性細胞數目Note. Compared to 6 h, * P < 0.05. Compared to 12 h,#P < 0.05. Compared to 24 h,& P < 0.05.Figure 2 LC3-II positive cell number at different time points after reperfusion

2.3 Western blot結果

TMEM166及LC3-II在再灌注6 h時已經表達，在12 h時表達明顯增強，二者均在24 h達到高峰，強度約為6 h的3倍(P< 0.05)，48 h后開始下降，與12 h之間相比差異無顯著性，但與6 h相比差異有顯著性(圖3、圖4)。

注：與6 h比較，*P < 0.05；與12 h比較，#P < 0.05；與24 h比較，& P < 0.05。圖3 再灌注后TMEM166在不同時間點的表達水平Note. Compared to 6 h,*P < 0.05. Compared to 12 h,#P < 0.05. Compared to 24 h,& P < 0.05.Figure 3 Relative expression level of TMEM166 protein at different time points after reperfusion

注：與6 h比較，*P < 0.05；與12 h比較，#P < 0.05；與24 h比較，& P < 0.05。圖4 再灌注后LC3-II在不同時間點的表達水平Note. Compared to 6 h,*P < 0.05. Compared to 12 h,#P < 0.05. Compared to 24 h,& P < 0.05.Figure 4 Relative expression level of LC3-II protein at different time points after reperfusion

3 討論

缺血致神經細胞死亡的機理尚未十分明確，目前的研究表明腦缺血后神經細胞可以呈現三種死亡方式：壞死(necrosis)、凋亡(apoptosis)和自噬(autophagy)[5]。近年來，有關細胞死亡可能機制的研究引起了學者們極大的關注，細胞壞死和凋亡已被眾多學者進行了深入細致的研究[4, 6-9]，然而對自噬的研究和認識卻略顯欠缺。壞死主要發生在缺血中心區，為病理性細胞死亡，是快速且不可逆的細胞死亡。而細胞凋亡主要發生在半影區，進展較慢。然而，有相當一部分的神經元死亡并不表現出典型的細胞壞死或凋亡的特征，并具有截然不同的細胞死亡機制，稱為自噬性細胞死亡或Ⅱ型程序性細胞死亡(autophagic cell death)[10-11]。自噬是迄今為止發現的廣泛存在于真核細胞中的一種代謝途徑，可通過自噬小體-溶酶體途徑，或通過影響凋亡和壞死的發生、發展對細胞死亡進行調控，LC3-II是其特征性標記物，研究發現LC3-II的活性與細胞自噬水平呈正相關[12]。目前，自噬在急性腦缺血后神經元損傷過程中的作用及其機制尚不明確。

TMEM166是人們最新發現的和細胞生存密切相關的基因之一，又稱FLJ13391，TMEM166蛋白為溶酶體/內質網相關蛋白，但目前國內外對TMEM166的報道主要集中在腫瘤領域[13- 14]，其在腦缺血后神經細胞凋亡過程中的作用研究尚不多見。

最新的研究發現，Hela細胞轉染TMEM166質粒后，表現出了凋亡和自噬的典型特征，而應用小干擾RNA下調TMEM166的表達，則可以抑制饑餓誘導的Hela細胞自噬[1]。該研究團隊還發現，Hela細胞在轉染后期同時也表現出了細胞凋亡的典型特征，說明TMEM166可以同時誘導Hela細胞的自噬和凋亡。此外，TMEM166可以明顯抑制人非小細胞肺癌腫瘤細胞的發生[15]。Chang等[13]用腺病毒Ad5-TMEM166轉染人類腫瘤細胞后發現，mTOR(哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，自噬負性調節蛋白)及其下游p70s6k的磷酸化水平明顯下調，腫瘤細胞自噬水平升高，提示TMEM166可能是通過調節mTOR的活性來調節細胞自噬。該研究團隊進一步發現TMEM166有顯著的抗膠質母細胞瘤生物活性的作用，分別在三種膠質母細胞瘤(U251、U87和SHG44)中過表達TMEM166后，膠質母細胞瘤的自噬活性增加，增殖呈劑量及時間依賴性被抑制，且mTOR/RPS6KB1信號通路被抑制。除此之外，TMEM166在胰腺炎患者的胰島α細胞中有強表達，在胰腺腺泡細胞癌的細胞膜及胞漿中也有不同程度的表達，令人感興趣的是TMEM166的表達在其它類型的胰腺癌，如胰腺導管癌、導管內乳頭狀黏液性腫瘤、粘液性囊腺瘤、實性乳頭狀瘤和胰腺神經內分泌腫瘤中卻沒有檢測到[2]，這可能提示TMEM166作用的組織特異性。除了腫瘤細胞外，在角膜內皮營養不良的小鼠動物模型中，鋰可以通過上調TMEM166的表達進而通過誘導角膜細胞自噬而起到視力保護作用[2]。TMEM166與神經干細胞的再生與分化也關系密切，研究發現TMEM166通過調節自噬參與調控胚胎神經系統的發生發育[14]。TMEM166在心肌重塑中也有重要作用，TMEM166敲除鼠的心肌細胞自噬活性被抑制，心肌出現纖維化、心室肥厚，最終發展成各種心肌病甚至導致死亡[17]。

本研究旨在探討TMEM166在小鼠腦缺血再灌注后腦組織中的表達，結果證實TMEM166在缺血再灌注損傷6 h后即有明顯表達，其陽性細胞的數目及表達強度均隨著再灌注時間的延長而增加，在再灌注后24 h達到高峰，其強度約為再灌注6 h時的3倍左右。而這一過程與自噬特異性標記物LC3-II的表達趨勢基本吻合。LC3-II的表達在缺血后6 h開始，12 h繼續升高，同樣在24 h達到高峰，48 h回落。這說明TMEM166與腦缺血后神經細胞的自噬之間可能存在某種關聯，這一發現與本課題組之前發表的在大鼠模型中的研究結果類似，TMEM166在大鼠腦組織有表達，腦缺血再灌注損傷后表達明顯上調，在再灌注24 h達到高峰，此時動物神經功能的損害也最為顯著[18]。

綜上所述，TMEM166可能與腦缺血再灌注損傷后的神經細胞自噬密切相關，其機制有待進一步研究。在這一成果基礎上，本課題組已經制備TMEM166基因敲除鼠，將對其誘導神經細胞凋亡的具體機制進行深入研究。