狨猴人工輔助生殖技術及基因修飾模型研究進展

滕永康，劉云波

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021)

普通綿耳狨猴(Callithrixjacchus，common marmoset)，屬于類人猿亞目，狨猴科。它們是一種體型較小的非人靈長類動物，來源于巴西東北部，近大西洋的熱帶雨林中[1]。它們因頭頂耳后各有一簇白色絨毛而得名。目前，狨猴在生物醫學領域[2]研究較為廣泛，尤其是在生殖生物學、神經科學、藥物動力學及藥物的毒性篩查[3]、干細胞研究[4-5]、自身免疫性疾病、再生醫學、感染性疾病動物模型，如登革熱[6]方面都具有較大的潛能。

成年狨猴體長20 ～ 30 cm，體重一般為350 ～ 450 g；人工繁育群體中的狨猴壽命，一般為(148.5±6.1)個月[7]。狨猴喜群居，一般每個群體的成員數量在10只左右；彼此可通過復雜的發音，進行個體和群體間交流[8]。每個家族中只有一只雌性狨猴有交配權利，多數狨猴是一雌一雄制。雌性狨猴妊娠期為140 ～ 150 d，分娩多在夜晚，一胎可分娩2 ～ 4只，3只居多，或異卵雙生[9]，但每胎成活一般不超兩個[10]。泌乳不抑制發情，即分娩后可立刻進入下一個卵泡發育期，準備受孕，因而一年可生兩胎。幼猴生長14 ～ 15月可達性成熟。但在野外，在一個家族群體內，不是族長的雄性沒有交配權。狨猴的發情周期為(28.63±1.1) d，其中卵泡期為(8.25±0.3) d，黃體期為(19.22±0.63) d[11]。Cui等[12]首次對雌性狨猴進行生殖系統解剖探究，發現狨猴陰道總長3.4 mm；子宮平均大小為8.4 mm × 10.0 mm × 6.4 mm；卵巢為5.3 mm × 4.3 mm × 3.8 mm；輸卵管平均長度為10.5 mm，寬度為1.5 mm。

1 狨猴輔助生殖技術

1.1 狨猴精液采集

精子采集是輔助生殖的重要環節，采集的精子數量和質量直接關系到整個實驗的成敗。目前精子采集主要有：附睪采集法，人工按摩刺激法，直腸或陰莖電刺激法，陰道沖洗法，陰莖震蕩刺激法，假陰道法等等。狨猴雄性外生殖器較小，因此，針對狨猴精液采精主要為直腸電刺激方法，陰道沖洗法和陰莖震動刺激法。1991年，Cui等研究者[13]嘗試使用直腸電刺激方法成功采集到精液。Morrell等[14]對比陰道沖洗法和直腸電刺激法后發現，陰道沖洗法在成功率、重復性上優于直腸電刺激，但操作較繁瑣，易摻雜陰道分泌物造成細胞污染。Morrell等[15]從附睪采集精子懸浮液，濃度為每毫升1.5 × 107～ 5.2 × 107個，存活率73% ～ 91%，活力70% ～ 90%。Kuederling等[16]嘗試使用陰莖震動刺激方法進行采精，結果發現：陰莖震動刺激采精是更優化的采精方法，總量和精子濃度均是直腸電刺激方法采精的3 ～ 4倍。后來，Schneiders等[17]對采精震動器進行改進，采精效率大幅提高(由52.3%提到至89.4%)。同時，無需麻醉，大部分研究者仍在沿用此方法。

1.2 超數排卵和卵母細胞采集

可超數排卵前利用同期發情來獲得更多的供體，同期發情分為延長黃體期和縮短黃體期兩種，狨猴多采用后者，Summers等[18]研究發現，前列腺烯醇(PGF2α)可以作為前列腺素的相似物來加速黃體消融，同時還發現在卵泡期的第8 ～ 17天即黃體期的中后期PGF2α作用效果更顯著。Gilchrist等[19]發現，竇狀卵泡的總數與卵巢的質量和體積成正比，與動物年齡成反比，而且，通過每天測定卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)、孕酮發現，動物在卵泡期的第9.4天處于排卵期，為狨猴繁殖生產提供了基礎數據。針對狨猴的超數排卵，科學家們做了很多優化，Marshall等[20]使用重組人卵泡刺激素(rhFSH)進行超數排卵刺激，每天劑量分別有0、10、25和50 IU，每天刺激50 IU的實驗組動物平均產生應答的卵泡數明顯高于其他三個組分，卵泡數平均為(14.1±1.6)個，在產生的380個卵泡中有267個未排卵的卵泡，采集回收率為51%，第一極體率為85.2%，受精率為57%，桑椹胚率為58%，囊胚率為47%，透明帶破處率為34%。

卵母細胞的采集方法上，在2003年，Marshall等[20]借助腹腔鏡，利用自制裝置穿刺采卵，回收率為51%。

1.3 卵母細胞體外成熟

狨猴卵母細胞的培養基的研究最早可以追溯到1993年，Wilton等[21]使用α-MEM培養基培養卵母細胞時發現胚胎發育狀況與卵母細胞成熟狀況關系不大，與卵母細胞預孵育的時間有關，孵育9 ～ 11 h胚胎發育較好。隨后Gilchrist等[22]明確提出在Waymouth’s培養基中體外培養的狨猴卵泡可以促進優勢胚胎移植前的發育。Tkachenko等[23]發現表皮生長因子(EGF)對卵母細胞的作用效果顯著，即低濃度抑制、高濃度促進。Tkachenko等[24]還發現，雌二醇在狨猴卵母細胞體外成熟以及胚胎發育過程中發揮著重要作用，但前提是需要維持在某個合適的濃度范圍內。

1.4 胚胎獲取

胚胎獲取方法分為自然交配后胚胎沖洗回收和體外受精培養，體外受精又分為精卵共培養(invitrofertilization，IVF)和單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)方法。1994年，Thomson等[25]介紹了一種沖洗子宮獲得著床前胚胎的方法，平均每次沖洗一個胚胎，效率較低。Ishibashi等[26]創造性地使用超聲波介導實現無創傷胚胎回收，可以回收90%的排卵物，很大地提高了胚胎回收效率。2009年，Sasaki等[27]發現，自然交配后獲得的胚胎比通過IVF獲得的胚胎擁有更好的生殖潛力。研究者對于IVF方法中受精液以及胚胎培養液進行了較多的探索研究，嘗試使用的受精液包括G1.2[20](57%)、G2-HSA[28](88.5%)、TYH[29](60% ～ 78.6%)。2014年，Takahashi等[30]首次利用ICSI方法生產出狨猴子代，并比較了不同注射時間囊胚率和受孕率，發現在相對于第一極體出現3 ～ 10 h，在1 ～ 2 h組的囊胚率最低。同時，研究者還對比了ICSI和IVF的效率，發現在卵裂率和囊胚率數據上，二者沒有明顯差異。在提高受精率上，Morrell等[31]利用陰道沖洗法，獲得精子后分別使用鮮精和凍精進行受精情況比較，詳見表1。

表1 陰道沖洗法獲得精子后，鮮精和凍精的受精情況比較Table 1 Comparison of fertilization between fresh and cryopreserved sperm by washing the vagina

研究者Valle等[32]利用計算機精液分析系統通過分析精子頭部尺寸和形態來進行精子亞群分布，進而挑選較好的精子進行受精，提高生殖成功率。同期，江勤芳等[33]針對非人靈長類動物體外受精及胚胎移植的手術室建設及使用進行了探討，為相關科研人員提供參考。

1.5 胚胎移植

狨猴的胚胎移植主要有四部分內容：胚胎的選擇、受體動物的選擇、移植方法和早期妊娠檢查，按照供受體動物生理狀態可分為同步處理和異步處理兩種，同步處理是供受體同時在排卵期后5 ～ 8 d進行胚胎移植，異步處理則是供體比受體進入排卵期早至少2 d，即受體排卵后2 ～ 4 d而供體是6 ～ 8 d，結果顯示異步移植明顯優于同步移植[34](著床率前者44%，后者9%；妊娠率前者33%，后者0%)。Hanazawa等[35]發明了一種微創經腹部收集胚胎的方法，經驗證，在早期胚胎(受精卵/桑椹胚)回收效率上比傳統的解剖收集胚胎更高效(前者76.1%，后者52.6%)，創傷小，術后恢復快，為狨猴胚胎收集開辟新方向。Takahashi等[30]成功使用腹腔鏡輔助的陰道套管的方法進行胚胎移植，37個囊胚期胚胎移植入20個受孕母體中，4只受孕，成功率10.8%。Ishibashi等[36]嘗試借助超聲影像使用更少的移植量(小于1 μL)完成冷凍和晚期胚胎操作并取得成功，研究者使用更細的注射器，避免了回聲沿套管流動對視覺造成干擾，結果受孕率和出生率均高于之前2 ～ 3 μL注射量的結果。

2 狨猴基因修飾

轉基因技術原理主要有原核注射法，精子載體法，病毒感染法，轉基因體細胞核移植法，誘導性多能干細胞法等，目前轉基因技術在嚙齒類動物上發展已經比較成熟，然而人類和嚙齒類之間在解剖學和組織學、生理學存在較大差異，使得部分人類疾病不能用嚙齒動物建模，因而生命科學領域需要開發建立非人靈長類動物轉基因技術方法[37]。與此同時，人們在關于狨猴作為非人靈長類動物進行轉基因技術研究是否合適的話題上開始形成分歧。Olsson等[38]以綜述的形式總結分析了各方的觀點，指出，以狨猴作為動物模型進行研究不會引起更多的倫理爭議。而后經過探索，轉基因靈長類動物制備方法主要以病毒感染法為主，2009年，Sasaki等人[27]通過向胚胎中注射在蔗糖溶液中自失活的，含EGFP基因的慢病毒載體生產出首批轉基因狨猴。同時，還實現了轉基因的種系傳遞。F2代狨猴同樣攜帶相應基因型和表型，表明，一種新型的與人基因型更相近的人類疾病動物模型建立了。之后，狨猴因操作方便，繁育高效，不含致命的人畜共患病如皰疹B病毒[37]等優勢在近幾年受到越來越多的重視，研究者Matsuzaki等[39]嘗試使用含有GFP的腺相關病毒9型(rAAV-9)載體進行狨猴枕大池和小腦皮質注射，兩種給藥途徑均實現在運動神經元中的高效轉導。Borel等[40]對9只狨猴腰椎穿刺在蛛網膜下腔注射分別含有miR-SOD1的rAAV rh10病毒載體，并以GFP作為對照組，給藥23 d后發現，在整個脊髓處實現SOD1基因沉默。2016年，Park等研究者[41]成功制作出8只能夠表達基因編碼鈣離子指示劑(GECIs)的轉基因狨猴，在不同的組織中鑒定到鈣離子指示劑穩定存在并發揮作用，本次實驗依然采用向受精卵中注射攜帶GFP和GECI家族的慢病毒載體的方式獲得轉基因受精卵，并通過檢測轉基因狨猴的卵泡中GECI的表達確定該方法實現種系傳遞，同時實現活體動物的神經活動功能性光學成像。該研究者還指出，狨猴腺相關病毒或慢病毒介導的轉基因方法不僅受限于病毒的接種時間，而且還需考慮病毒的嗜親性、滴度、注射劑量以及啟動子的構建和神經元的基因表達。而在此期間，研究者在其他非人靈長類動物基因修飾方面也取得可喜成果，2014年，Liu等[42]通過TALEN介導使一個X染色體連鎖的MECP2基因發生突變，生成出生即患有雷特綜合征的轉基因恒河猴和食蟹猴，同時未檢測到脫靶突變，證明TALEN介導的靶突變能夠成為制作攜帶人類疾病的非人靈長類動物模型的有力工具。同年，牛昱宇[43]成功利用CRISPR/Cas9方法獲得基因定向敲除食蟹猴，研究者選擇了分別與性別決定、代謝系統和免疫系統疾病密切相關的Nr0b1、PPAR-γ和Rag1基因，注射成功率為44.6%，對兩只幼猴進行鑒定發現均為陽性。初步證實了利用TALEN和CRISPR/Cas9系統進行非人靈長類動物進行基因修飾的可行性。

3 展望

目前基因修飾水平的趨于成熟為非人靈長類轉基因動物制作創造了很多機遇，轉基因狨猴因生物學特性、飼養成本、繁殖效率等方面的特定優勢為干預和治療人類疾病的發展奠定了良好的基礎。當然，也存在著不足之處。第一，狨猴輔助生殖技術的很多細節仍不成熟，如卵母細胞及胚胎的凍存復蘇，胚胎的體外培養和移植效率等，使得研究者在獲得轉基因狨猴前需要很多的供體和受體猴，無形中加大了實驗成本，增加了基因修飾狨猴研究開展和普及的難度，限制了基因修飾狨猴的研究發展。第二，目前狨猴轉基因技術主要存在日本、美國等國家，國內對狨猴尤其是轉基因狨猴的研究仍處在初步階段，很多研究技術和方法仍需進一步驗證和摸索，研究工作任重而道遠。第三，由于具有生殖能力的胚胎干細胞和體細胞核移植尚未廣泛應用在非人靈長類動物上，狨猴的轉基因技術仍局限在慢病毒介導的方法上，外源基因的隨機插入不能從根本上達到精確基因修飾效果，需要進一步研究和完善基因修飾方法。第四，據以往的報告，狨猴的胚胎成功移植率并不高[30, 34, 36]，因此整個狨猴的ART各個環節，均有待進一步研究和提高。盡管目前轉基因狨猴技術還存在種種不足，相信隨著狨猴人工輔助生殖技術體系的不斷完善，一方面狨猴資源數量會得到更快的提升，另一方面，技術細節的不斷優化，也能相對降低狨猴的實驗使用數量，同時，相信隨著越來越多聚焦狨猴的科研力量的加入，更多的轉基因技術方法將被應用在狨猴上，即產生更多寶貴的非人靈長類動物人類重大疾病模型，無疑對生命科學乃至整個生物醫學的基礎應用研究意義重大。