胰腺癌特異性差異表達lncRNA相關的ceRNA調控網絡的構建

何江洋，李奉喜，黃垂國，牛躍平

1)鄭州大學第二附屬醫院普通外科 鄭州 450014 2)廣西國際壯醫醫院普通外科 南寧 530021 3)鄭州大學第二附屬醫院泌尿外科 鄭州 450014

胰腺癌是一種高度惡性的消化系統腫瘤，60%的胰腺癌患者確診時已發生遠處轉移，術后5 a生存率僅為5%左右[1-2]。因此迫切需要能早期診斷及預測胰腺癌預后的生物標志物。人類基因組轉錄序列中絕大部分為長度大于 200 個核苷酸的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)[3]。現有研究[4]表明，lncRNA可通過與蛋白質、DNA和RNA相互作用等多種方式，在表觀遺傳學、轉錄及轉錄后水平調控基因的表達[5]，在腫瘤發生發展以及預后中具有重要作用[6-7]。MicroRNA(miRNA) 是一類由內源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA，可通過mRNA上的miRNA反應元件(micorRNA response element，MRE)調控mRNA的表達[8]。每一個miRNA可調控多達幾百個mRNA的轉錄，而每一個MRE又可與多個miRNA相結合[9-10]。2011年，Salmena等[11]提出競爭性內源性RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)假說，認為lncRNA可通過MRE吸附miRNA，從而抑制miRNA的作用，間接調控蛋白編碼基因的表達；miRNA在該網絡中起關鍵作用[12-13]。隨后大量的lncRNA被發現具有潛在的ceRNA特性[14]。本研究從TCGA數據庫中下載胰腺癌及其癌旁樣本的RNA表達譜數據，構建胰腺癌特異性ceRNA調控網絡，探尋胰腺癌診斷和治療的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1胰腺癌及其癌旁樣本資料的獲取從TCGA公共數據庫(http://cancergenome.nih.gov/)中下載178個胰腺癌樣本和4個正常胰腺樣本的詳細資料。178例均經病理診斷確診為胰腺癌。患者≥65歲85例(47.8%)，男女比例約為1.28，G2+G3期患者145例(81.5%)，病理分期Ⅱ期患者149例(83.7%)。

1.2胰腺癌差異表達lncRNA、miRNA和mRNA的篩選收集樣本的RNA表達譜數據，調用R語言DESeq包，采用nbinomTest函數對比分析胰腺癌與正常胰腺組織的lncRNA、miRNA和mRNA表達水平，篩選出差異倍數(fold change，FC)>2.0且錯誤發現率(false discovery rate，FDR)<0.05的差異表達lncRNA、miRNA及mRNA[15]。

1.3ceRNA調控網絡的構建根據篩選出的lncRNA，應用lncRNA-miRNA在線預測數據庫miRcode[16]匹配出與其相互作用的miRNA，應用miRNA靶基因預測數據庫(miRDB、miRTarBase和TargetScan)篩選出靶mRNA。篩選出的靶mRNA應滿足兩個條件：至少包含于miRDB、miRTarBase和TargetScan中的兩個數據庫；是胰腺癌差異表達mRNA。基于上述篩選出的lncRNA、miRNA及mRNA，采用Cytoscape v3.5.0構建并繪制ceRNA調控網絡。采用KOBAS 3.0對靶基因進行KEGG信號通路和GO功能注釋。

1.4生存分析結合胰腺癌患者的生存資料，采用K-M曲線法繪制生存曲線，分析ceRNA調控網絡中的lncRNA及mRNA與胰腺癌預后的關系。

2 結果

表1 胰腺癌特異性差異表達lncRNA相關的ceRNA調控網絡的組成

紅色菱形：lncRNA;紅色長方形：miRNA;綠色橢圓形：mRNA

圖1胰腺癌特異性差異表達lncRNA相關的ceRNA調控網絡

2.2生存分析生存分析結果表明， lncRNA MIR600HR、C9orf139、RP11-796E2.4和AC104809.2與胰腺癌患者預后密切相關(圖2)，靶基因CDHR1、CYFIP2、IL10RA、MAP3K1、SSH2、TSPAN1和VAMP1與胰腺癌預后密切相關(圖3)。

表2 KEGG信號通路和GO功能分析

圖2 胰腺癌特異性差異表達lncRNA的生存曲線

圖3 胰腺癌特異性mRNA的生存曲線

3 討論

ceRNA假說的提出為腫瘤發病機制的研究提供了重要線索和方向，也為腫瘤的診斷和治療研究提供了新的理論依據。研究[17]表明，ceRNA網絡中的lncRNA、miRNA及mRNA處于一定的平衡狀態，一旦平衡被打破將導致疾病的發生。目前胰腺癌早期診斷及治療等方面缺乏可靠的特異性標志物，構建胰腺癌特異性ceRNA調控網絡可為尋找胰腺癌診斷和治療的潛在靶點提供思路和方向。研究[18-21]證實lncRNA相關的ceRNA調控網絡在胃癌、肝癌以及前列腺癌等腫瘤中發揮重要作用，而在胰腺癌中相關研究較少。Kallen等[22]發現 lncRNA H19可吸附let-7，從而影響其靶基因HMGA2在胰腺癌中的表達。Wang 和Liu等[23-24]研究發現lncRNA HOTTIP-005、RP11-567G11.1和MALAT1在胰腺癌和正常組織中的表達具有顯著差異性，認為這些lncRNA可作為潛在的診斷或預后評估的生物標志物。研究[25]發現，過表達的lncRNA NUTF2P3-001可競爭性結合miR-3923，解除miR-3923對KRAS的抑制，進而促使胰腺癌細胞的增殖和侵襲。

本研究成功構建了胰腺癌特異性差異表達lncRNA相關的ceRNA調控網絡。該網絡包括12個關鍵lncRNA，生存分析結果表明，其中4個lncRNA(MIR600HR、C9orf139、RP11-796E2.4和AC104809.2)與胰腺癌預后密切相關；這4個lncRNA有可能成為預測胰腺癌預后的潛在生物標志物。研究[26]表明，lncRNA RP11-796E2.4位于促凋亡蛋白BTG1基因附近，在鞘氨醇激酶1抑制劑(SKI-5C)的作用下，其在腎母細胞瘤中表達增高；用siRNA沉默RP11-796E2.4后，SKI-5C在人腎母細胞瘤細胞中的促凋亡作用明顯降低。而關于lncRNA MIR600HR、C9orf139及AC104809.2的研究國內外尚未有相關報道。

構建的ceRNA調控網絡中包括5個miRNA(miR-142、miR-144、miR-424、miR-10b和miR-206)。有研究[27-30]發現，miR-142、miR-144、miR-424、miR-10b和miR-206表達水平與胰腺癌細胞的增殖、侵襲以及轉移密切相關。另外， ceRNA調控網絡中的54個靶基因中，LCP1、BCL11A、BACH2、NPY1R、PPP1R16B、BCL2、SEPT6、MAP3K8、MAP3K1、MYBL1、TSPAN1、NIN、ETS1和STEAP2可在allOnco數據庫中被檢索到。生存分析結果表明，靶基因CDHR1、CYFIP2、IL10RA、MAP3K1、SSH2、TSPAN1和VAMP1與胰腺癌預后關系密切。MAP3K1和TSPAN1高表達的胰腺癌患者預后差，而CDHR1、CYFIP2、IL10RA、SSH2和VAMP1高表達有助于延長胰腺癌患者的生存時間。allOnco數據庫收錄的腫瘤相關基因均經過實驗證實與多種腫瘤的發生發展關系密切，MAP3K1和TSPAN1均屬于致癌基因。故作者認為MAP3K1和TSPAN1對胰腺癌的發生發展以及預后均發揮了調控作用。研究[31-32]發現MAP3K1與乳腺癌和大腸癌的發生密切相關。Chen等[33]發現TSPAN1基因在結直腸癌中呈高表達，且與結直腸癌的組織學分級、淋巴結轉移及TNM分期密切相關，高表達TSPAN1的結直腸患者預后更差。Lu等[34]也證實了TSPAN1在胃癌中具有致癌作用。TSPAN1還被證實與皮膚鱗狀細胞癌以及前列腺癌等腫瘤密切相關[35-36]。

綜上所述，我們成功構建了胰腺癌特異性lncRNA相關的ceRNA調控網絡，為胰腺癌的診斷、治療和預后評估研究提供了潛在靶點。