miR
--200a與金雀異黃酮對胃癌細胞生長及侵襲能力的影響

孫慶敏,王 進

南京中醫藥大學附屬醫院藥學部 南京 210029

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在發展中國家尤為高發；中國胃癌患病人數占全世界的42%[1]。目前手術切除仍是原發性胃癌最主要的治療手段，但實際上手術時有可能就已經發生了腫瘤細胞的轉移擴散。因此如何減少胃癌術后復發轉移已成為提高胃癌療效的關鍵[2]。近年來，隨著分子生物學的發展和對癌癥發病機制的深入研究，腫瘤的治療也正在發生變革，特別是精準化治療概念提出之后，針對胃癌的治療更需結合病理、基因及蛋白組學等資料。諸多研究已經證實miRNAs參與了腫瘤的發生、發展及預后。我們之前的研究[3]證實miR--200a可抑制卵巢癌的侵襲，并與卵巢癌的臨床病理分期及轉移密切相關。諸多研究[4--5]已發現金雀異黃酮通過影響一系列的細胞進程如細胞周期、凋亡、血管新生等發揮抗癌作用。我們之前的研究[6--7]也發現金雀異黃酮可抑制胃癌7901細胞、葡萄膜黑色素瘤細胞增殖。因此，我們觀察了金雀異黃酮與miR--200a單用及聯用對胃癌細胞生長、侵襲的影響，并探討可能的相關分子機制。

1 材料與方法

1.1材料人胃癌細胞株MGC803、BGC823、MKN45由江蘇省中醫院中心實驗室提供。RPMI 1640 培養基及胎牛血清(Hyclone公司)，miR--200a mimic、NC mimic(上海吉瑪基因公司)，金雀異黃酮(Sigma公司)，MTT檢測試劑盒(碧云天公司)，8 μm Transwell 小室(BD公司)，雙熒光素酶報告基因檢測系統(Promega公司)，Sybr green(Toyobo公司)，兔抗人EphA2 抗體、兔抗人GAPDH抗體(Santa Cruz公司)，Lipo--2000(Life Technologies公司)，逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司)，TaqMan?MicroRNA 逆轉錄試劑盒(ABI公司)，Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(millipore，WBKLS0100)。德國Hettich MikrO 200R冷凍離心機，酶標儀、細胞培養箱(Thermo fisher公司)，倒置顯微鏡(Olympus公司)，ABI Prism 7300 PCR系統(ABI公司)，GloMax 96 微孔板發光檢測儀(Promega公司)。

1.2細胞培養與分組取MGC803、BGC823、MKN45細胞，在含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，于體積分數5%CO2、37 ℃條件下培養。

分別取MGC803、BGC823、MKN45細胞，接種于96孔板，每種細胞分別接種12孔，每孔約5 000個細胞，培養24 h后分為4組(每組3孔)：陰性對照組(轉染NC mimic)、金雀異黃酮組(加入50 μmol/L金雀異黃酮)、miR--200a組、聯合組(miR--200a mimic轉染聯合50 μmol/L的金雀異黃酮處理)，6 h后，換成完全培養基。

1.3各組細胞生長情況3種細胞分別按照1.2分組處理后培養24 h，每孔加入50 μL MTT，繼續培養4 h，然后每孔加入500 μL Formazan溶解液，直至在光學顯微鏡下觀察Formazan全部溶解，酶標儀上于570 nm處測定吸光度(A)。細胞存活率=(實驗組A值-調零孔A值)/(對照組A值-調零孔A值)，其中對照組為不加任何處理的細胞。

1.4各組細胞侵襲能力的變化3種細胞分別按照1.2分組處理后，將1×104個細胞接種到Transwell的頂部室中，將含有體積分數10%胎牛血清的培養基填充在底部室中。 24 h后，從膜的頂部除去非侵入性細胞。然后用甲醇固定細胞，結晶紫溶液染色，100倍倒置顯微鏡下計數5個視野的細胞數，取平均數。

1.5各組細胞EphA2mRNA表達的檢測3種細胞分別按照1.2分組處理后，提取RNA。采用熒光定量RT--PCR評估EphA2 mRNA的表達水平。EphA2正、反向引物(5'～3')：GGGACCTGATGCAG AACATC和AGTTGGTGCGGAGCCAGT;GAPDH：TGTTCGACAGTCAGCCGC和GGTGTCTGAGCGAT GTGGC。使用2-ΔΔCT方法計算EphA2 mRNA的表達水平。

1.6各組細胞EphA2蛋白表達的檢測取BGC823和MKN45細胞，按照1.2分組處理48 h后在RIPA裂解緩沖液中裂解，蛋白通過100 g/L SDS--PAGE分離并轉移到PVDF膜。將膜與兔抗人EphA2抗體(按1 ∶200稀釋)或兔抗人GAPDH抗體一起孵育，加入二抗，ECL顯色，并用Quantity One軟件定量。以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.7統計學處理采用SPSS 15.0處理數據，采用2×2析因設計的方差分析探討miR--200a和金雀異黃酮單用或聯用對胃癌細胞生長、侵襲能力及EphA2 mRNA和蛋白表達的影響。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細胞生長的影響MTT結果顯示，金雀異黃酮可抑制MGC803細胞生長，而miR--200a可抑制MKN45細胞生長，二者對這兩株細胞生長的影響均無交互作用。金雀異黃酮和miR--200a單用均可抑制BGC823細胞生長，且二者聯用有協同作用，見表1。

表1 miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細胞存活率的影響

2.2miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細胞侵襲能力的影響金雀異黃酮可抑制MGC803和MKN45細胞侵襲能力，而miR--200a可抑制MGC803和BGC823細胞侵襲能力，二者聯用對這3種細胞侵襲能力的影響均無交互作用。見表2。

表2 miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細胞侵襲能力的影響

2.3miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細胞EphA2mRNA相對表達量的影響在MGC803細胞中未觀察到miR--200a或金雀異黃酮對EphA2 mRNA表達的影響；但在MKN45細胞中miR--200a可抑制EphA2 mRNA表達；在BGC823中金雀異黃酮可一定程度抑制EphA2 mRNA表達(P=0.054)。見表3。

表3 miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細胞EphA2 mRNA相對表達量的影響

2.4miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細胞EphA2蛋白表達的影響miR--200a及金雀異黃酮均可抑制BGC823細胞EphA2蛋白的表達，且二者聯用有協同作用；MKN45細胞中，金雀異黃酮單用及與miR--200a聯用均可抑制EphA2蛋白表達。在MGC803細胞中，EphA2蛋白表達量極低，故未做給藥或轉染實驗。見圖1、表4。

1～4:分別為陰性對照組、miR--200a組、金雀異黃酮組及聯合組

圖1miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細胞EphA2蛋白表達的影響

表4 miR--200a和(或)金雀異黃酮對胃癌細胞EphA2 蛋白表達的影響

3 討論

諸多研究[4--5]已經發現金雀異黃酮通過影響一系列的細胞過程如細胞周期、凋亡、血管新生等發揮抗癌作用。我們之前的研究[6]也發現金雀異黃酮可抑制胃癌7901細胞增殖。因此本研究我們擴大在另外3株胃癌細胞中觀察金雀異黃酮對胃癌細胞生長及侵襲的作用。結果顯示，金雀異黃酮單用可抑制MGC803、BGC823細胞生長及MGC803、MKN45細胞侵襲。

miR--200家族被發現與胃癌生成、淋巴結轉移、腫瘤浸潤程度及分級密切相關[8]，且諸多基于我國范圍內的胃癌人群研究[9--11]已顯示miR--200a在胃癌中低表達，提示miR--200a在胃癌中可能發揮抑癌基因的作用。鑒于此，本研究觀察了給予外源性miR--200a mimic是否可以抑制胃癌細胞生長，結果發現miR--200a可抑制胃癌細胞MKN45、BGC823生長，而且其與金雀異黃酮可協同抑制BGC823細胞生長。3種胃癌細胞株遺傳背景信息的差異可能是導致其協同效應不一致的原因。此外，Transwell實驗也證實miR--200a可抑制胃癌細胞MGC803和BGC823侵襲，這一發現為之后開發抗癌藥物提供了新途徑。

miRNAs通過與靶基因轉錄的mRNA的3’非編碼區結合，從而調節靶基因的表達，在腫瘤發生發展過程中發揮癌基因或抑癌基因作用。我們之前的研究通過生物信息學及熒光素酶報告系統在卵巢癌中證實了EphA2為miR--200a的直接功能靶基因之一。因此，本研究在預實驗中觀察同時轉染miR--200a及EphA2 3’UTR熒光質粒的胃癌細胞，結果發現miR--200a可抑制其熒光活性，可見在胃癌中EphA2也為其靶基因之一，但是否為功能靶基因尚需進一步驗證。EphA2作為蛋白酪氨酸激酶跨膜受體成員之一，與腫瘤的血管生成、上皮間質轉化密切相關。前期研究[12]已發現EphA2陽性表達與胃癌的發生、發展及轉移密切相關。本研究結果顯示miR--200a可抑制BGC823胃癌細胞中EphA2蛋白表達，且聯合金雀異黃酮可進一步加強該作用。

綜上所述，miR--200a與金雀異黃酮可能通過調控EphA2抑制胃癌細胞生長及侵襲，且二者存在部分協同作用。上述實驗研究為后期針對miR--200a或EphA2開發藥物提供了理論基礎，亦為miRNAs藥物聯合傳統藥物治療胃癌提供了研究基礎。