10個DNA分子標記在小麥抗條銹病輔助育種上的應用

張成兵， 劉青利， 張先平， 李 云， 邢麗紅， 張 羽

(1.陜西省漢中市農業科學研究所，陜西漢中 723000； 2.陜西省渭南市臨渭區種子管理站，陜西渭南 714000；3.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中 723000)

條銹病是由條形柄銹菌小麥專化型(Pucciniastriiformisf. sp.tritici)引起的小麥葉部病害，是世界上小麥的主要真菌病害，也是我國小麥生產中重要的病害之一，在我國曾多次大流行[1]。防治小麥條銹病主要通過使用化學農藥和種植抗性品種2種途徑，化學防治通常成本高、污染環境且殘留的成分危害人類健康。因此，發掘新的優良抗條銹病基因及其緊密連鎖的分子標記，培育持久高抗病品種具有經濟、有效、環保等重要意義。隨著DNA分子標記技術的發展，相繼開發了一些與條銹病抗性基因緊密連鎖的分子標記，利用已知抗條銹病基因的分子標記，可以從DNA水平上對育種材料進行快速、準確的檢測和評價，進而明確小麥品種中抗性基因的分布，為高效開展條銹病抗性基因聚合育種帶來了新的契機。Chen等篩選到了與抗性基因Yr5緊密連鎖的隨機擴增多態性DNA(random amplification polymorphism DNA，簡稱RAPD)和簡單序列重復(simple sequence repeat，簡稱SSR)標記[2]。Weng等篩選到了與Yr9緊密連鎖的SSR標記Xgwm582(3.7 cM)和Xgwm264(37.9 cM)[3]。邵映田等在Yr10的供體親本Moro中篩選到與Yr10緊密連鎖的擴增片段長度多態性(amplification fragment length polymorphism，簡稱AFLP)標記[4]。Peng等研究了與抗條銹病基因YrH52、Yr15連鎖的分子標記[5]。劉亞萍在小麥1BS上篩選到Yr24的SSR標記Xgwm11(6.1 cM)和Xgwm273(7.1 cM)[6]。嚴俊等在抗病材料H52中篩選到抗性連鎖的抗性基因類似物(resistance gene analogue，簡稱RGA)分子標記[7]。殷貴鴻等從小麥抗條銹病骨干親本周8425B中篩選得到與抗性基因緊密連鎖的片段長度為343 bp的抗病基因類似序列多態性分子標記技術(resistance gene analogue polymorphism,簡稱RGAP)標記Xrga-1[8]。李嘉從濟麥22/Avocet S和濟965261中分別找到了抗條銹病基因的連鎖SSR標記Xwmc658、Xgwm582[9]。朱曉娜等篩選到抗條中32號小種(CYR32)的特異RAPD標記S20[10]。目前，已有57個抗條銹病基因被正式命名，編號從Yr1到Yr54(其中有等位基因)，以第1個抗條銹病基因Yr10為代表的數個基因被克隆。但生產中由于大面積種植單一小麥品種，致使條銹菌在定向的選擇壓力下迅速變異，并引起優勢小種種群的增長和小麥條銹菌新小種的產生，進而導致一個抗銹品種在生產上能大面積應用的時間較短，隨著其原有抗銹性的喪失而失去應用價值，特別是新的條銹菌生理小種條中32(CYR32)和條中33(CYR33)的出現和蔓延，導致多數主栽品種失去抗性。目前，對CYR32和CYR33表現抗性的主效基因僅剩Yr5、Yr15、Yr24、Yr26(與Yr24等位)、YrH52、YrZH84等。李在峰用26個國內外條銹菌生理小種對98個我國小麥品種(系)進行苗期基因推導，發現攜帶Yr9基因的材料占43%，其次為Yr26基因[11]。伍玲等檢測了2004、2005年四川省小麥區域試驗72份材料中抗條銹基因Yr5、Yr10、Yr15的分布情況，攜帶Yr15基因的材料最多，占11.11%，其次為Yr5基因，占5.56%，再次為Yr10基因，占 1.34%[12]。李峰奇等對126份我國黃淮麥區重要的小麥品種(系)進行抗條銹病基因分子檢測，發現攜帶Yr9基因的小麥品種頻率最高，為41.6%，其次是Yr5、Yr10、Yr15、Yr26基因[13]。張勝利等用不同材料檢測抗性基因Yr5-156、Yr9-2、Yr24-1在不同材料中的分布情況，發現在感性材料中也能擴增出和抗病材料同樣的特異性目標條帶[14-16]。王欣等對青海省育成和引進的137份小麥品種進行Yr10、Yr15基因的特定序列擴增區域(sequence characterized amplified regions，簡稱SCAR)標記和SSR標記以及1BL/1RS易位的復合標記進行了檢測，結果顯示1BL/1RS易位占參試材料的16.1%，其次為Yr15基因，占13.9%，再次為Yr10基因，占2.9%[17]。薛文波等對74個主栽小麥品種進行了連續2年的成株期抗病性鑒定結合抗性基因檢測，攜帶Yr9基因的占32.43%，攜帶Yr26基因的占6.76%，攜帶Yr17基因的占5.41%，74個供試材料中未檢測到Yr5、Yr10、Yr15、Yr18基因[18]。張玉薇等利用Yr10、Yr18基因以及1BL/1RS易位的SCAR或STS標記在75份2006—2010年國家審定的小麥品種中的分子檢測顯示，攜帶Yr10基因的占17.33%，攜帶Yr18基因的占1.33%，1份材料中同時檢測到Yr10+Yr18基因組合，25份材料中含有 1BL/1RS 易位片段[19]。李敏州等對115份陜西省主栽和后備小麥品種(系)進行抗性基因檢測，結果顯示攜帶Yr9基因的占35.65%，攜帶Yr5基因的占2.61%，攜帶Yr18基因的占 2.61%，攜帶Yr26基因的占1.74%，115份材料中均不含Yr10基因[20]。徐琪等構建了檢測Yr1、Yr2基因的分子標記gwm372和gwm382，并用此檢測來自我國各麥區的181份小麥高代系材料，結果顯示Yr1、Yr2基因在181份小麥高代系材料中占比較低[21]。陳天青等調查了140份2013—2014年西南地區主要的小麥種質資源中幾個抗銹病基因的分布情況，顯示攜帶Yr26基因的占41.4%，其次為Yr9基因，占37.9%，Yr10、Yr15、Yr18基因占比較低，Yr9+Yr26基因組合出現的頻率較高[22]。孫建魯等對100個小麥品種資源抗條銹病基因Yr5、Yr10、Yr15、Yr18、Yr24、Yr26的檢測結果顯示，攜帶Yr18基因的占19.00%，攜帶Yr10基因的占4.00%，攜帶Yr15基因的占2.00%，攜帶Yr5基因的占1.00%，供試材料中均不含Yr24、Yr26基因[23]。李北等對重慶地區的18份當地主栽品種和89份高代品系材料進行了7個已知抗條銹基因的分子檢測，供試材料中攜帶Yr26基因的最多，占 36.45%，其次為Yr9基因，占19.63%，攜帶Yr17基因的占15.89%，攜帶Yr18基因的占2.80%，沒有檢測到含Yr5、Yr10、Yr15基因的材料[24]。黃亮等對我國小麥主產區的79個小麥品種(系)進行抗條銹病基因檢測，結果表明供試小麥品種中1B/1R易位的占44.3%，攜帶Yr10基因的占10.1%，攜帶Yr5基因的占5.1%，攜帶Yr18基因的占3.8%，攜帶Yr26基因的占1.3%[25]。白微微等檢測46份新疆麥區小麥材料中Yr10基因及1BL/1RS易位的分子標記，發現 1BL/1RS 易位的占19.57%，攜帶Yr10基因的占2.20%[26]。我國小麥品種中抗條銹基因過于單一，在我國條銹病流行區主栽品種中，有效抗源主要集中在92R系列(攜帶Yr26)、貴農系以及少數攜帶Yr24的國際玉米小麥改良中心(centro internacional de mejoramientode maizy trigo，簡稱CIMMYT)抗源種質[27]。

本研究以陜西省漢中地區大面積種植品種漢麥5號(漢5)和漢麥6號(漢6)為母本，以抗源品種貴農22中選出的一個品系為父本進行雜交，以多代定向選擇選育出的高代品系為供試材料，通過檢測與Yr5、Yr9、Yr15等基因連鎖的分子標記在供試材料中的分布情況，以期為新品種(系)的抗性遺傳基礎鑒定及持久抗性材料選育提供技術支撐。同時，選取與Yr9基因遺傳距離不同的2個連鎖分子標記進行檢測，以驗證分子標記與目標基因之間是否發生交換。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料45份，其中陜西省漢中地區大面積種植品種6份(漢5、漢6、D002、川麥42、9503、川麥107)，漢5與貴農22雜交后選育的高代品系4份(漢5-1、漢5-2、漢5-3、漢 5-4)，漢6與貴農22雜交后選育的高代品系32份(漢6-1至漢6-32)，育種材料2份[貴農22-1、貴農22(病圃)]，抗銹性鑒定誘發品種1份(銘賢169)，所有材料均由陜西省漢中市農業科學研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取及PCR 小麥基因組DNA采用十二烷基苯磺酸鈉(SDS)法提取，并采用0.8%瓊脂糖凝膠檢測基因組DNA的質量。PCR反應體系：2×TaqMaster Mix 15 μL，10 μmol/L正反引物各1 μL，DNA模板1 μL，反應總體積為30 μL，用ddH2O補足。反應程序：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性50 s，x℃(此溫度根據引物而定)退火50 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產物，用銀染法顯色拍照。

1.2.2 引物信息 抗性基因的引物信息如表1所示，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 結果與分析

Yr5基因的特異引物Yr5-156擴增的目標帶大小在 156 bp 左右[2]。由圖1可知，以100 bp DNA Marker為對照，攜帶Yr5基因的材料在156 bp左右均能擴增出特征性條帶，反之則沒有條帶。

表1 引物信息

注：“？”代表遺傳距離不清楚。

由表2可知，在45份供試小麥材料中，42份材料檢測出Yr9-2基因，占93.33%；38份材料檢測出Yr5基因，占 84.44%；13份檢測出Yr10基因，占28.89%；16份檢測出YrH52基因，占35.56%；21份檢測出YrZH84基因，占 46.67%；17份材料檢測出Yr24基因，占37.78%；36份材料檢測出Yr9-1基因，占80.00%；26份材料檢測出YrJ22基因，占57.78%；18份材料檢測出S20標記，占40.00%。供試材料中，攜帶最多的為Yr9-2基因，其次為Yr5基因，所有材料中均不含Yr15基因。

由表3可知，與抗小麥條銹病有關的10個DNA分子標記檢測中，其中同時在1個材料中檢測到4個抗性DNA標記的最多，占22.22%；含有9個標記位點的材料只有漢6-31，占供試材料的2.2%；含有8個標記位點的材料有5份，分別為漢6、漢5-1、漢6-16、漢6-24、漢6-25，占供試材料的 11.1%。可見這些材料除不含對CYR32、CYR33表現抗性的主效基因Yr15外，其他基因如Yr5、Yr24、Yr26、YrH52、YrZH84等均存在，這些材料可以在育種及生產中廣泛推廣應用，尤其是漢6-31，可以加大該主栽品種的推廣力度。

3 討論與結論

本研究采用與小麥抗條銹病基因連鎖的10個分子標記對45份陜西省漢中地區主要小麥種質資源進行檢測，銘賢169在小麥抗條銹病基因的圖位克隆定位中常被用來作為感病品種，本研究檢測的10個分子標記在銘賢169中均沒有檢測到，可以看出試驗結果可信度較高。張勝利等用Yr5、Yr9基因抗性標記對小麥條銹病表現不同的抗感材料檢測時，在感性材料中發現也能擴增出和抗病材料同樣的特異性目標條帶，一方面暗示了抗病表型與基因關系的復雜性，不是簡單的一對一關系，另一方面可能由于標記與基因之間沒有達到完全的共分離程度，導致標記與目的基因之間發生了交換[14-15]。本研究利用與Yr9基因連鎖(Xgwm264-Xgwm582-Yr9)的遺傳距離不同的2個標記(Xgwm582、Xgwm264)同時檢測，從結果可以看出，用來檢測Yr9基因的2個分子標記結果有所差異，有的材料可能在Xgwm264與Yr9基因之間發生了交換。如果以與Yr9基因緊密連鎖的SSR標記Xgwm582為依據，在45份供試小麥材料中，Yr5基因的檢出率最高，其次為Yr9-1(Xgwm582)基因，說明攜帶Yr5、Yr9基因的材料是目前陜西省漢中地區小麥種質資源中的有效抗源，這與Yr9基因曾廣泛應用于小麥抗條銹病育種有關。來源于野生二粒小麥的抗性基因Yr15、YrH52雖然都被定位在染色體1BS上，但本研究檢測Yr15、YrH52基因的不一致結果也與Peng等推測其為2個不同的基因[5]一致。貴農22是陜西省漢中市農業科學研究所在全國小麥品種抗病性變異觀察圃(漢中點)中選出的一個抗源材料，韓德俊等也曾報道，在目前我國條銹病流行區主栽品種中，有效抗源主要集中在92R系列(攜帶Yr26基因)、貴農系和少數攜帶Yr24基因的CIMMYT抗源種質[27]。貴農22作為抗源材料之一， 與漢中麥區的主栽品種雜交，選育抗條銹病的小麥新品種與新材料具有很好的實踐意義，本研究的結果也印證了這一點，在選育的高代品系中含有8個及以上分子標記位點的材料有6份，這為以后的選育工作奠定了基礎。

表2 抗條銹病基因在供試材料中的分布情況

注：“+”代表檢測到特定條帶，“-”代表未檢測到特定條帶。

表3 供試材料攜帶的抗性標記位點數目

在小麥抗條銹病的分子標記開發中，很多標記是基于特定材料而構建的，其變異位點不一定適合對所有小麥資源進行抗感檢測，在其功能標記未探明前，往往與目標基因有多個連鎖標記，在分子標記輔助育種進行選擇時應選擇遺傳距離最小的標記，同時應盡量把分子標記檢測與田間抗病性鑒定結合起來共同篩選抗性資源。另外，由于新的抗條銹病生理小種的出現，在小麥抗條銹病育種中應不斷發掘、擴增新的小麥條銹病抗源，以培育新的優勢抗病品種。