竹蓀間作對橡膠園土壤微生物區系與群落功能多樣性的影響

劉 敏， 張廣宇， 張永北， 李智全， 冀春花

(海南省農墾科學院，海南海口 570206)

林下經濟是一種人工生態經濟復合系統，其投入小、見效快。近年來，林下經濟蓬勃發展，其中林菌循環經濟模式是最具林業特色的林下經濟發展模式[1]。林菌循環經濟模式就是利用林木枝椏作為栽培料，在林下陰蔽環境中開展食用菌栽培，再將菌糠還田培土以促進林木生長的一種可持續發展的復合種植模式。目前，各地區因食用菌種類、林地資源差異等因素形成了多樣的林菌循環經濟模式。海南省作為天然橡膠主產區，光溫資源豐富，林下空間廣闊，十分適合中高溫型食用菌生產。近年來，竹蓀因市場前景廣闊、喜偏酸性土壤等特點已在海南省橡膠園大面積推廣。

食用菌菌糠含有豐富的植物養分、有機質和微生物，施入土壤后，會對土壤物理、化學、生物性質產生一系列影響，可提高土壤孔隙度，增強土壤通透性，提升土壤養分含量，增加土壤微生物種群及數量，促進作物生長[2-3]。陳兵等研究表明，竹蓀間種后，將菌糠施入使膠園，土壤水分狀態顯著得到改善，有機質、速效氮、速效鉀、有效磷等養分含量顯著提高，使地力培肥，橡膠產量提高[4]。而施用竹蓀菌糠對橡膠園土壤微生物影響的研究還未見報道。土壤微生物作為反映土壤肥力的重要指標，其種類、數量和活性可以更全面、真實地反映土壤的營養狀態[5]。因此本研究采用傳統培養和BIOLOG ECO微平板法測定相結合的方法，研究竹蓀間種對橡膠園土壤微生物區系和群落功能多樣性的影響，試圖以此評價“橡膠-竹蓀”膠菌循環經濟模式的土壤改良效果，以期為推廣該模式提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

土壤樣品采集地點位于海南省萬寧市北大鎮某橡膠林地，土壤類型為赤紅壤，橡膠定植時間為2002年，種植規格為 2.8 m×7 m，采用“一行三畦兩溝”模式在橡膠園行間栽培長裙竹蓀。土壤樣品采集采用“S”形5點混合法，分別于竹蓀種植前(2015年12月8日)、竹蓀采收時(2016年4月19日)和竹蓀采收后3個月(2016年7月12日)用木鏟從地表向下取0～20 cm新鮮土樣。除種植前，土壤樣品采集時需先將上層栽培料剝離干凈。樣品采集后低溫運輸，立即送回實驗室進行測定。

1.2 土壤微生物數量測定

根據《土壤微生物研究原理與方法》[6]，采用平板計數法測定土壤中細菌、真菌、放線菌、氨化細菌、自生固氮菌數量，采用最大或然數(most probable number，簡稱MPN)計數法測定土壤中纖維素分解菌、硝化細菌、反硝化細菌數量。細菌、真菌、放線菌、氨化細菌、自生固氮菌、纖維素分解菌、硝化細菌、反硝化細菌分別使用營養瓊脂、玫瑰紅鈉、高氏1號、牛肉膏蛋白胨、阿須貝無氮、赫奇遜、銨氧化細菌、反硝化細菌培養基培養。

1.3 土壤微生物群落碳源代謝利用測定

采用BIOLOG ECO微平板法。具體方法如下：稱取10 g新鮮土壤于90 mL滅菌去離子水中，置于搖床振蕩10 min，按10倍稀釋法制成10-2土壤稀釋液，靜置2 min，取上清液接種到BIOLOG ECO PlateTM板(BIOLOG Inc，USA)的微孔內，每孔150 μL。將微孔板置于28 ℃培養箱中培養9 d，并每隔 24 h 用BIOLOG微生物鑒定儀讀取590、750 nm處的吸光度。取120 h平均吸光度(average well color development，簡稱AWCD)進行主成分分析。

微生物對各類碳源相對利用率的測定參考皺春嬌等的方法[7]，以所有樣品中6 類碳源的最大AWCD值記為100%，其余各樣品中各類碳源AWCD值與最大值的比值即為相對利用率。

1.4 多樣性指數

通過計算McIntosh、Shananon-Wiener和Simpson指數來反映土壤微生物碳源利用多樣性。

1.5 數據處理

使用Excel 2010和SPSS 19.0進行相關數據分析。

2 結果與分析

2.1 竹蓀間作對橡膠園土壤主要微生物類群數量的影響

由表1可知，橡膠園間作竹蓀后，土壤微生物總數明顯增加，采收時和采后3個月分別增加了66.72%和124.25%。采收時和采后3個月細菌總數略有增加；真菌總數顯著減少，分別減少了 71.84%和67.82%；放線菌總數明顯增加，分別增加了 1 966.67% 和2 833.33%，差異達極顯著水平。由此可見，間作竹蓀可提高橡膠園土壤微生物總量，促進放線菌生長，抑制真菌生長。

表1 竹蓀間作前后橡膠園土壤主要微生物類群數量

注：同列數據后標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標有不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。表3同。

2.2 間作竹蓀對橡膠園土壤微生物特殊生理類群的影響

由表2可知，采收時，橡膠園土壤中氨化細菌、自生固氮菌、纖維素分解菌、硝化細菌、反硝化細菌數量較種前分別增加了292.77%、107.06%、1 166.67、900.00%、9 900.00%。采后3個月，除反硝化細菌，各微生物生理群數量較采收時分別增加了43.56%、18.18%、110.53%、66.67%。間作前，氨化細菌、自生固氮菌為橡膠園土壤中主要生理類群；采收時，反硝化細菌數量驟增，替代自生固氮菌成為主要生理類群；采后3個月，纖維素分解菌替代反硝化細菌成為主要生理類群。由此可見，竹蓀間作對橡膠園土壤各類群微生物生長繁殖有促進作用，主要生理類群隨采樣時間變化而更替。

表2 竹蓀間作前后膠園土壤微生物特殊生理類群數量

2.3 間作竹蓀對橡膠園土壤微生物群落功能多樣性的影響

2.3.1 土壤微生物利用碳源動力學特征 AWCD表征土壤微生物群落對碳源的利用情況及活性，是表征土壤微生物群落碳源代謝能力的一個重要指標[8]。間作前后橡膠園土壤微生物利用31種碳源的AWCD值變化曲線如圖1所示，可見AWCD值隨培養時間的增長而升高，碳源利用程度增大，168 h后趨于穩定狀態。間作前后橡膠園土壤AWCD值變化速率(斜率)表現為采后>采收>種前，采后3個月橡膠園土壤AWCD值增長最快，微生物對碳源的總體代謝活性最高。對168 h(拐點)處AWCD值進行方差分析，結果表明，采收時、采后3個月與種前土壤AWCD值差異極顯著(P<0.01)。

2.3.2 土壤微生物對各類碳源的利用特征 BIOLOG ECO微平板的碳源包括12種碳水化合物類、5種羧酸類、6種氨基酸類、4種多聚物類、2種酚酸類和2種胺類[9]。竹蓀間作前后橡膠園土壤中微生物對6類碳源的相對利用率如圖2所示，可見碳水化合物、氨基酸類碳源有較高的利用率，其次為羧酸類和多聚物類，胺類、酚酸類的利用率最低。采收時，土壤微生物對各類碳源利用率均有所提高，其中多聚物類與種植前差異顯著，酚酸和碳水化合物類差異極顯著；與采收時相比，采后3個月除碳水化合物類碳源利用率略微下降外，其他類碳源利用率均有所升高，但幅度較小，僅羧酸類與采收時差異顯著。

2.3.3 土壤微生物功能多樣性指數 選取168 h處AWCD值，計算McIntosh、Shananon-Wiener和Simpson指數來反映土壤微生物碳源利用多樣性。如表3所示，采收時各土壤微生物碳源利用多樣性指數均高于種植前，Shannon-Wiener指數差異顯著，McIntosh和Simpson指數差異極顯著。采后3個月各指數較采后略有增加，但差異不顯著。由此可見，間種竹蓀后，橡膠園土壤微生物的均勻度、豐富度和優勢度均有所提高。

表3 供試土壤中微生物碳源利用多樣性指數

2.3.4 土壤微生物群落功能多樣性的主成分分析 對3組土壤樣品31種碳源168 h處的AWCD值進行主成分分析，得到特征值大于1的主成分2個，其中第1主成分方差貢獻率為71.41%，第2主成分方差貢獻率為28.59%。由表4 各碳源在第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)上的載荷值可知，對PC1貢獻大(載荷值>0.8)的碳源有21種，其中碳水化合物類9種，多聚物類4種，氨基酸和羧酸類各3種，酚酸類和胺類各1種。對PC2貢獻大(載荷值>0.8)的碳源有5種，其中氨基酸類2種，碳水化合物類、羧酸類和胺類各1種。取主成分1和2得分載荷作圖，來表征間作前后土壤中微生物群落碳源代謝特征。如圖3所示，竹蓀間作前后土壤中微生物對碳源的利用情況不同，具有明顯差異。

3 討論

土壤中細菌、放線菌和真菌數量及其比例是衡量土壤肥力及健康狀況的重要指標。一般說來，土壤中細菌、放線菌密度越高，該土壤肥力水平也就越高。研究表明，雙孢菇、香菇和茶樹菇等菌糠還田均可提高土壤微生物數量，提升細菌、放線菌所占比例，促進養分活化與吸收[10-12]。本試驗結果顯示，橡膠園間作竹蓀后，土壤細菌、放線菌數量增加，真菌數量減少，放線菌與真菌數量比值(A/F值)明顯提高，橡膠園土壤肥力得到了提升，同時，真菌相對數量的降低可能會對減輕橡膠病害起到積極作用[12]。

土壤中存在自生固氮菌、氨化細菌、硝化細菌、反硝化細菌、纖維分解細菌等微生物生理群，它們在土壤養分循環和污染降解轉化中起著重要作用[6]。間作竹蓀后，橡膠園土壤5種微生物量均有所增加。其中，自生固氮菌、氨化細菌、硝化細菌與纖維素分解菌都是參與土壤養分循環的有益微生物生理群。自生固氮菌數量增加，可增加土壤氮素營養；氨化細菌、硝化細菌數量增加，有利于含氮有機物富集、分解和氮素循環速率的提高；纖維素分解菌數量增加，可加快植物殘體轉化和碳素循環，為膠樹生長提供更多碳素和能源[13-15]。然而，反硝化細菌數量增加會造成氮素損失，采收階段出現這種現象的原因可能是菇畦覆蓋形成了微氧條件，為其提供了良好的生存環境。但隨著竹蓀栽培料持續分解和氧氣的進入，反硝化細菌數量在采后3個月明顯下降，占比僅為13.42%。也有研究表明，反硝化細菌數量與土壤養分呈正相關，對提高土壤肥力有促進作用[16]?？偟膩碚f，竹蓀栽培料或菌糠的施入促進了微生物類群向更好的趨勢發展。

表4 31種碳源在第1、2主成分上的載荷值

大量研究表明，土壤中加入有機物料能夠提高有機質含量及微生物群落多樣性。不同腐熟水平的有機物料會造成土壤微生物的選擇適應性，出現一些種群富集而一些種群數量降低的現象，進而導致微生物對碳源的利用能力出現顯著差異[16-18]。利用BIOLOG ECO微平板法進行功能多樣性研究的結果表明，竹蓀間作增強了橡膠園土壤微生物對碳源的代謝活性，同時提高了土壤微生物碳源利用的多樣性。主成分分析結果表明，間作前后，土壤微生物碳源利用特征出現分異，結合微生物對6類碳源的相對利用率發現，這種差異可能是羧酸類、酚酸類、多聚物類和碳水化合物類碳源引起的。在整個過程中，以橡膠木屑為主要成分的栽培料經過分解，使土壤中各類碳源得到積累，微生物大量繁殖，碳源利用率升高，其中碳水化合物和羧酸類物質為土壤微生物的主要碳源，碳水化合物類碳源相對利用率最高。氨基酸是土壤最大的有機氮庫，有機物料的施入可誘導土壤微生物對氨基酸類碳源的利用[19]，這與本研究中竹蓀菌糠的作用結果一致，主要原因在于竹蓀菌絲體和子實體含有豐富的氨基酸；酚酸類物質對植物生長有抑制作用，可由植物殘體和凋落物降解產生，積累到一定水平時會對目標植物產生毒性[20-22]，在本研究中，雖然種植后酚酸類碳源相對利用率極顯著升高，但僅約為20%，毒性作用有限。

有研究表明，氣候變化可引起微生物群落結構變化并對微生物活動產生較大影響[23]。海南島屬熱帶季風氣候，5—10月為雨季。竹蓀采收在雨季前完成，采收時，氣候對土壤微生物特性的影響有限。然而采后3個月進入雨季，與采收時相比，溫度升高，土壤含水量增加，菌糠分解加速，微生物生長代謝加快，橡膠園土壤微生物量、微生物碳源代謝活性和多樣性在間作模式和氣候的共同影響下得到進一步提高。

綜上所述，本研究運用培養法和BIOLOG ECO微平板法分析竹蓀間作對橡膠園土壤微生物特性的影響，研究表明，竹蓀間作可提高橡膠園土壤有益微生物數量、微生物碳源代謝活性和多樣性，促進土壤養分循環和肥力提升。土壤微生物作為土壤肥力的重要指標，其測定結果在一定程度上可以反映竹蓀間作對橡膠園土壤的改良效果，但土壤肥力是土壤物理、化學、生物特性的綜合表現，結合物理、化學性質進行相關分析將有助于進一步揭示“橡膠-竹蓀”膠菌循環經濟模式對橡膠園土壤改良的效果。

4 結論

(1)間作竹蓀可促進橡膠園土壤有益微生物生長繁殖，改變微生物區系，提高土壤肥力。

(2)間作竹蓀后，橡膠園土壤微生物群落AWCD值、Simpson-Wiener指數、Shannon指數和McIntosh指數顯著增加，微生物碳源代謝活性和多樣性提高。

(3)橡膠園土壤微生物利用的碳源主要是碳水化合物和氨基酸類，其次為羧酸和多聚物類，酚酸和胺類的利用率較低。

(4)間作竹蓀后，橡膠園土壤微生物碳源利用特征出現分異，在分異中起主要作用的是羧酸類、酚酸類、多聚物類和碳水化合物類碳源。