巨菌草內生固氮菌與解磷菌互作效應及其混合菌肥制備

林標聲， 汪麗芳， 張凱麗， 王澤輝， 林占熺，3

(1.龍巖學院生命科學學院，福建龍巖 364012； 2.福建農林大學生命科學學院，福建福州 350002；3.國家菌草工程技術研究中心，福建福州 350002)

生物固氮菌肥近年來在小麥、玉米、水稻等農作物種植中已開始被廣泛使用，相對于傳統化學氮肥，微生物固氮菌肥效率高、污染小，是一種環境友好型生物肥料，對改良土壤環境、提高作物產量均有重要的經濟和社會效益[1]。固氮菌肥有僅含固氮菌的單菌株制劑和固氮菌與解磷菌、解鉀菌聯合的多菌株制劑。相關試驗結果表明，無論是單菌株制劑還是多菌株制劑，均對作物生長有一定的促進作用，但多菌株制劑的施用效果一般要強于單菌株制劑。原因可能是多菌株制劑中不同類型的微生物可以互相提供生長基質和養分，如一些固氮菌對解磷細菌的解磷作用也十分有利，而一些解磷菌生理代謝物質能促進固氮菌的生長[2]。目前所報道的固氮菌肥多采用聯合固氮菌，如棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)、圓褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)等，但關于變棲克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)固氮菌肥的報道較少[3]。此外，多年來研究者對固氮菌、解磷菌混合菌肥的應用效果說法不一，存在較大爭議，需要進一步探討[4-5]。因此，本研究以從巨菌草中分離得到的主要固氮菌群變棲克雷伯氏菌為固氮菌株，選擇適宜的解磷菌混合培養，研究兩者間的相互作用，并據此制備固氮菌、解磷菌混合菌肥，研究對作物的促生作用，以期為今后微生物固氮菌肥的規?；a和應用提供依據，使固氮菌肥在農業生產上實現“以氮促磷、以磷增氮”的良好效果。

1 材料與方法

1.1 菌株與玉米種子

固氮菌：變棲克雷伯氏菌，分離自巨菌草成熟期根部，由筆者所在實驗室保存。解磷菌：膠質芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)，對無機磷有較強的分解能力，由筆者所在實驗室保存。玉米種子品種：仲玉988，從當地市場購買。菌肥配制原料：巨菌草，選用拔節期或成熟期的莖、葉部分，粉碎后低溫烘干，過100目篩；菌草食(藥)用菌菌糟，選用無木屑，僅用菌草栽培的食(藥)用菌菌糟，低溫烘干、粉碎，過100目篩；營養液，配方為紅糖3～5 g、硫酸鎂0.05～0.15 g、過磷酸鈣1～2 g、水100 mL。

1.2 培養基

Ashby無氮培養基配方：甘露醇10 g/L，KH2PO40.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，CaSO4·2H2O 0.1 g/L，CaCO35.0 g/L，pH值7.0～7.2；磷細菌培養的有機磷培養基配方：葡萄糖10 g，硫酸銨0.5 g/L，酵母浸粉0.5 g/L，氯化鈉 0.3 g/L，氯化鉀0.3 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，硫酸亞鐵 0.03 g/L，硫酸錳0.03 g/L，卵磷脂0.2 g/L，碳酸鈣1.0 g/L，pH值7.0～7.2，固體平板添加瓊脂20 g/L；磷細菌培養的無機磷培養基配方：葡萄糖10 g/L，磷酸鈣5 g/L，硫酸銨 0.5 g/L，酵母浸粉0.5 g/L，氯化鈉0.3 g/L，氯化鉀0.3 g/L，硫酸鎂 0.3 g/L，硫酸亞鐵0.03 g/L，硫酸錳0.03 g/L，pH值7.0～7.2，固體平板添加瓊脂20 g/L；固氮菌、接磷細菌混合培養的無氮培養基配方：蔗糖7.5 g/L，磷酸二氫鈉2.0 g/L，硫酸鎂 0.5 g/L，氯化鈉0.5 g/L，碳酸鈣0.1 g/L，氯化鐵0.005 g/L，磷灰石2.0 g/L，pH值7.0～7.2；LB培養基配方：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH值7.0～7.2。

1.3 方法

1.3.1 巨菌草內生固氮菌變棲克雷伯氏菌解磷能力判定 將變棲克雷伯氏菌在無氮液體培養基中培養至對數生長期的菌液進行梯度稀釋后，分別涂布到有機磷和無機磷固體平板中，測定變棲克雷伯氏菌單菌落在2種培養基中的溶磷圈直徑(mm)；另取對數生長期的菌液，按1%的量分別接入有機磷、無機磷液體培養基中，于30 ℃、150～180 r/min振蕩培養至對數生長期，測定2種培養基中的溶磷量(μg/mL)。分析變棲克雷伯氏菌的解磷能力，并以此為依據選擇適合的解磷菌混合培養。溶磷量的測定采用鉬酸銨比色法[6]。

1.3.2 變棲克雷伯氏菌與所選解磷菌的互作研究 (1)單菌培養：將變棲克雷伯氏菌與解磷菌分別接種至無氮液體培養基中，于30 ℃、150～180 r/min振蕩培養至對數生長期，取一定體積的培養液，消煮測定全氮含量；另取適量培養液于 4 000 r/min 離心8～10 min，取上清，測其溶磷量；同時采用稀釋涂平板法分別測定各培養液中變棲克雷伯氏菌和解磷菌的數量。全氮含量測定采用凱氏定氮法[7]，溶磷量的測定采用鉬酸銨比色法。(2)混合培養：將純培養至對數生長期的變棲克雷伯氏菌與解磷菌菌懸液分別按體積比1 ∶0.5、1 ∶1、0.5 ∶1 3種比例接種到100 mL無氮液體培養基中(培養瓶容量250 mL)，于 30 ℃、150～180 r/min振蕩培養至對數生長期，按純培養方法計算全氮含量、溶磷量和菌體數量，選擇最優比例用以制備混合菌肥。

1.3.3 變棲克雷伯氏菌單菌菌肥和混合菌肥的制備 為了提高變棲克雷伯氏菌的存活率，本試驗采用巨菌草作為載體制備固氮菌肥，菌肥菌株的分離和載體均來自同一物質。將活化后的變棲克雷伯氏菌和上述試驗選擇的最優比例的混合菌液分別接種到100 mL LB液體培養基中(培養瓶容量250 mL)，于30 ℃、150～180 r/min下振蕩培養至對數生長期。分別取150～200 mL菌液和650～750 g巨菌草、250～350 g菌草食(藥)用菌菌糟和100～150 mL營養液混合裝入帶呼吸閥的聚乙烯薄膜發酵袋中，在25～32 ℃下發酵5～10 d，若發酵物料明顯變軟、顏色變深，則發酵結束，按NY 411—2000《固氮菌肥料》檢測制備的單菌株制劑和多菌株制劑[8]。

1.3.4 變棲克雷伯氏菌單菌和混合菌肥的肥效試驗 將所制備的變棲克雷伯氏菌單菌株和多菌株制劑分別進行玉米盆栽的肥效試驗。共分為4組，分別為對照組1(僅為普通泥土)、對照組2(普通泥土加同等比例的菌草、菌糟，不含混合菌液)、試驗組1(普通泥土加5%固氮菌單菌株制劑)、試驗組2(普通泥土加5%多菌株制劑)。挑選剛冒牙尖、大小基本一致的玉米種子，播種于塑料杯中，每杯播種1粒，每組播種20杯，培養10～15 d，統計各組玉米出苗的時間、出苗率、根長和株高，對比2種菌肥肥效[9]。

2 結果與分析

2.1 變棲克雷伯氏菌解磷能力的測定

如表1所示，變棲克雷伯氏菌在有機磷培養基中的溶磷圈直徑和溶磷量均明顯高于無機磷培養基，表明變棲克雷伯氏菌具有較強的降解有機磷的能力，但其降解無機磷的能力較弱。因此，選擇筆者所在實驗室保存的對無機磷具有較強降解能力的膠質芽孢桿菌與其混合培養，以彌補變棲克雷伯氏菌無機磷解磷能力的不足。由表1還可以看出，膠質芽孢桿菌不僅具有較強的降解無機磷的能力，還具有一定降解有機磷的能力。

表1 變棲克雷伯氏菌解磷能力測定結果

2.2 變棲克雷伯氏菌與膠質芽孢桿菌的互作研究

由表2可知，未接種的無氮培養基對磷有一定的溶解作用；在變棲克雷伯氏菌純培養體系中，氮含量增加，溶磷量減少，表明變棲克雷伯氏菌具有固氮能力，但解磷能力較差；在膠質芽孢桿菌純培養體系中，溶磷量增加，同時產生了少量氮，表明膠質芽孢桿菌解磷能力較強，也具有一定的固氮能力。與變棲克雷伯氏菌和膠質芽孢桿菌純培養體系相比，2種菌按不同比例接種的混合培養體系的全氮含量和固氮菌數均有不同程度的增長，而溶磷量和解磷菌數有一定的下降。結果表明，在混合培養體系中，膠質芽孢桿菌可能分泌了某種代謝產物對變棲克雷伯氏菌生長具有促進作用，使固氮菌數量增多，全氮含量增加；而變棲克雷伯氏菌的代謝產物可能對膠質芽孢桿菌有一定抑制作用，加上混合培養體系中對營養物質的競爭造成了膠質芽孢桿菌數量減少，溶磷量也隨之減少。此外，變棲克雷伯氏菌和膠質芽孢桿菌的大量生長，需要利用部分可溶性磷來構建細胞成分，這也造成膠質芽孢桿菌數量降低。2種菌不同比例的接種試驗表明，當變棲克雷伯氏菌和膠質芽孢桿菌接種比例為1 ∶1時，體系中固氮菌數和全氮含量最高，在此比例下，體系中解磷菌數量和溶磷量較高，因此綜合分析后，選擇變棲克雷伯氏菌與膠質芽孢桿菌最優接種比例為1 ∶1。

表2 變棲克雷伯氏菌與膠質芽孢桿菌的相互作用

2.3 變棲克雷伯氏菌單菌株制劑和多菌株制劑的性能測定

表3結果表明：變棲克雷伯氏菌單菌株制劑和多菌株制劑各性能指標均符合NY 411—2000《固氮菌肥料》。但多菌株制劑有效活菌數更多、雜菌率更低、有機質含量更高、保存有效期更長，這可能是由于多菌株制劑含有膠質芽孢桿菌，其生長速度更快，使總有效活菌數更高，有機質含量增加，其他雜菌更不易生長，從而延長了保質期。

表3 所制備的菌肥與行業標準的比較

注：細度指過孔徑為0.18 mm標準篩的篩余物所占比例。

2.4 變棲克雷伯氏菌單菌株制劑和多菌株制劑的肥效試驗

表4結果表明，與對照組相比，2種菌肥對玉米均有一定的促生效果，但多菌株制劑組(試驗組2)的促生效果明顯優于單菌株制劑組(試驗組1)，其出苗時間減少了8.93%，出苗率、根長增量、株高增量分別提高了11.11%、16.92%、28.77%。多菌株制劑中解磷菌的添加對作物的生長起到了一定促生作用，這可能是由于解磷菌的添加有利于固氮菌生長和增加全氮含量，從而促進作物生長，這與“2.2”節的試驗結果一致。

表4 所制備的單菌株和多菌株制劑對玉米的促生試驗結果

3 結論與討論

變棲克雷伯氏菌屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，是根系聯合固氮微生物的一種[10]。筆者所在實驗室前期工作已證實，變棲克雷伯氏菌在巨菌草中豐度最高、含量最為豐富，為最主要的內生固氮菌群，并已在巨菌草成熟期的根部分離得到。變棲克雷伯氏菌具有較強的固氮作用，同時也具有一定的降解有機磷、分泌吲哚乙酸(IAA)和產鐵載體的能力，是固氮菌肥開發的優良種質資源[11]。但近年來，實踐證明單菌株制劑的固氮菌菌肥易失活、保質期短，其生產施用受到了一定限制[12]。因此，本試驗研究了變棲克雷伯氏菌與對無機磷有較強降解能力的膠質芽孢桿菌的相互作用，以期能提高變棲克雷伯氏菌固氮菌肥的總菌數，增加有效活菌數，延長有效期。試驗結果表明，與2種菌純培養體系相比，混合培養時體系中全氮含量和固氮菌數均有不同程度的增長，而溶磷量和解磷菌數有一定的下降；當2種菌按1 ∶1比例接種時，混合培養的協同作用最好。試驗所制備的多菌株制劑符合行業相關標準，其有效活菌數、有效期和對玉米盆栽的促生性能均優于單菌株制劑，具有更好的應用前景。

固定菌和解磷菌是微生物菌肥中常添加的2種微生物菌劑，研究表明，多菌株的混合培養有利于互相提供營養，消除不利因素，發揮有益的代謝協同作用[13]。本試驗結果表明，在固氮菌肥中添加解磷菌可以促進固氮菌生長，提高體系中的全氮含量，有利于作物生長，證實了多菌株制劑的促生效果確實優于單菌株制劑，多菌株復合菌肥的技術值得深入探討和推廣應用[14]。