樟腦對彩絨革蓋菌抑制響應的差異蛋白質組學分析

李 權， 李本鵬， 齊文玉， 任 凱， 林金國

(1.凱里學院，貴州凱里 556011； 2.福建農林大學材料工程學院，福建福州 350002)

木材的腐朽不僅會造成大量的經濟損失，還可導致嚴重的資源浪費，因此亟須對木材進行防腐處理[1]。為此，很多國家每年都投入大量的人力、物力研發新型木材防腐劑，以延長木材的使用壽命?，F今對植物提取物進行的研究通常集中在抑菌防腐、抗氧化及其應用等方面[2-5]。Voda等將含有酚類、酚醚類和芳香醛的植物精油用于對木材腐朽菌的抑菌測試，探討了精油中化合物的化學結構與抗真菌活性之間的關系，這是當前研究植物源提取物抑菌最常用的方法[6]；Lin等用5%肉桂葉的苯-乙醇提取物浸漬易腐朽的試材，明確了該植物提取物可以用于對易腐木材的防腐保護[7]；Tripathi等調查了馬纓丹根和莖的乙醇提取物對木材腐朽菌的抑制效果[8]；我國臺灣的Wang等從當地土肉桂葉片中提取精油用于木材防腐，結果發現提取物中的主要成分是肉桂醛，相比其他成分具有更強的抑菌防腐功效[9]；李堅等也都對當地的部分耐腐樹種進行了提取，研究了植物提取物的抑菌防腐效果[10]。經過檢測明確了幾種耐腐樹種的心材提取物對部分木霉菌、木材腐朽菌等真菌具有較強的抑制活性。

綜上所述，研究者已經探索了眾多類型的植物源提取物的抑菌防腐功效，也報道了大量植物提取物對木材腐朽菌良好的抑菌防腐效果。然而目前為止，對于植物源提取物的研究多集中在現象報道階段，真正的機制研究還很少，導致在發展和利用植物源提取物防腐方面存在著理論依據的缺失。本試驗通過雙向電泳技術與質譜分析技術相結合，分析受到樟腦抑制的木材腐朽菌與對照的差異表達蛋白質，從分子水平解析彩絨革蓋菌相關蛋白質的表達，最終為探索樟腦對木材腐朽菌的抑制機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 白腐菌為彩絨革蓋菌(Coriolusversicolor)，由福建農林大學生命科學學院提供。

1.1.2 儀器與藥品 (1)儀器：固相pH值梯度等電聚焦儀EttanTM-IPGphorTMⅢ IEF System；垂直板電泳儀EttanTMDaltⅡ Vertical System，附件包括MutiTemp ⅢTM恒溫水浴以及EPS 3501 XL電源；5800型MALDI-TOF/TOF；ImageScanner Ⅲ光密度掃描儀；超速冷凍離心機；THY-111B型恒溫培養振蕩器。(2)藥品：固相pH值梯度干膠條(immobiline pH gradient，pH值3～10，長度=24 cm)；IPG緩沖液、IPG覆蓋液、TCA、β-巰基乙醇、兩性電解質pharmalyte(pH值3～10)、丙烯酰胺、SDS、過硫酸銨、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、硫脲、DTT、CHAPS、碘乙酰胺。樟腦購置于福建青松股份有限公司，用化學合成法制得，含量>96.0%。將樟腦用三氯甲烷溶劑制備成濃度為10 mg/mL的溶液。丙酮為分析純，上海中試化工總公司生產。

1.2 方法

1.2.1 接種與培養 試驗地點為福建農林大學植物保護學院實驗室。在250 mL三角燒瓶中加入100 mL麥芽糖培養基(參照GB/T 13942.1—2009《木材耐久性能 第1部分：天然耐腐性實驗室試驗方法》麥芽糖瓊脂培養基的配制不加瓊脂)，用5 mm打孔器在培養好的白腐菌培養皿上取出3個菌柄放入麥芽糖培養基中，將濃度為10 mg/mL的樟腦溶液 1 mL 加入到三角燒瓶中，與對照一起放入28 ℃、40 r/min振蕩箱中培養14 d后取出并真空抽濾得到菌絲。

1.2.2 TCA丙酮法提取菌絲蛋白質 將抽干后的菌絲液氮研磨，加入20 mL的TCA/丙酮振蕩均勻后放入-20 ℃中沉淀過夜。將沉淀過夜后的樣品4 ℃、11 000 r/min離心 15 min，去上清，再加入20 mL-20 ℃預冷的冷丙酮(內含0.07%β-巰基乙醇)振蕩，靜置2 h，然后11 000 r/min離心15 min，去上清(重復2次，洗至沉淀白色)，再放到真空干燥箱中真空抽干。按適當20 μL/mg標準加入裂解緩沖液，保持25～30 ℃超聲溶解2 h，最后11 000 r/min離心15 min后取上清即為蛋白樣品，對蛋白樣品濃度定量(濃度范圍為5～10 μg/μL)后放入-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2.3 蛋白質雙向電泳

1.2.3.1 等電聚焦(IPG-IEF) 主動上樣，水化和等電聚焦在EttanTM-IPGphorTMⅢ IEF System上自動進行，程序設置如表1所示。聚焦完畢后，分別用膠條平衡緩沖液Ⅰ(加DTT 10 mg/mL)和平衡緩沖液Ⅱ(加碘乙酰胺 25 mg/mL)，各緩慢平衡15 min。取出膠條后用濾紙小心吸去殘余平衡液，用電極緩沖液潤洗后轉入濃度為10%的聚丙烯酰胺凝膠板中，加入相對質量標準的蛋白質，進行二向垂直電泳。

表1 IEF參數設置

1.2.3.2 二向電泳與染色 將平衡好的IPG膠條貼于凝膠玻璃板上，加入1 mL瓊脂糖封膠液封住膠條，將凝膠板插入EttanTMDALT Ⅱ Vertical System的緩沖液柜中。在16 ℃水循環條件下進行電泳，恒功率4 W/條，待示蹤溴酚藍至凝膠底部邊緣時停止電泳，取出凝膠后待固定液固定后進行考染。

1.3 凝膠圖像分析

凝膠顯色后用Image Scanner掃描儀進行圖像掃描，運用Image MasterTM2D Platinum 7.0凝膠圖像分析軟件進行 2-DE 圖譜分析。

1.4 膠內酶解

建立差異蛋白質表達譜后，將新鮮的考馬斯亮藍染色的蛋白質點從SDS-PAGE凝膠上割下切碎，置于96孔微孔板中。切碎的膠條首先用200 μL新鮮的含50 mmol/L NH4HCO3的50%乙腈溶液脫色2次，然后用200 μL乙腈干燥2次。干燥脫水的膠條加入消化液(含有12.5 ng/μL胰蛋白酶的20 mmol/L NH4HCO3溶液)孵育20 min，然后轉移到37 ℃孵育消化過夜。最后，用200 μL提取液(含5%甲酸的50%乙腈溶液)提取2次，收集上清液中的多肽合并。提取液在N2保護下干燥。

1.5 MALDI-TOF/TOF分析及數據的查詢

MALDI板用5800 MALDI-TOF/TOF分析儀(AB SCIEX)分析。每個點在m/z為700～3 600質譜范圍內采用正離子反射模式獲取一級質譜，激光累積1 000次激發。MS數據用內標進行校準，母離子的選擇按照如下標準：每點最多選擇50個母離子，信噪比最低設置為25，組分與組分間的質量偏差設置為0.2 u。串聯質譜采用2 500次激光累積和100分辨率的質量窗口(半峰高寬度，FWHM)，碰撞能量設置為 2 kV，MS/MS數據采用默認校準，得到的數據通過軟件GPS(V3.6)采用MASCOT(V 2.3)進行檢索。搜索參數如下：真菌蛋白質(1 757 520條序列；762 750 636個殘基)、胰酶酶切，1個漏切位點，一級質譜的容差為0.1 u，二級質譜的容差為0.6 u。經過數據庫檢索后，蛋白質得分>75分被認為鑒定成功(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 菌體總蛋白雙向電泳圖譜的繪制

設計3次生物學重復，從圖1可以看出，所得電泳圖譜背景清晰，蛋白質點分辨率高，蛋白質點大規模聚集現象和橫縱向拖尾少。經軟件對比發現，同一彩絨革蓋菌的3次生物學重復之間的蛋白質點重復出現率超過92%，試驗結果可靠性極高。樟腦處理后彩絨革蓋菌以及對照之間蛋白點的分布大體相似，個別點則有較明顯的差異，說明這2種樣品所表達的蛋白質的種類和數量有所差別。

2.2 凝膠掃描結果分析

采用Image MasterTM2D Platinum 7.0差異分析軟件對樟腦處理白腐菌與對照的雙向聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳圖譜進行比對分析，由圖2可知，2種蛋白雙向電泳圖譜格局基本一致，蛋白質點主要集中在等電點(pI)4～7的范圍內。樟腦處理白腐菌電泳圖和對照樣電泳圖中分別可分辨別出444、433個蛋白質點，對各樣品蛋白質雙向電泳圖譜進行比較，蛋白質豐度變化在2倍以上，并且3次生物學重復試驗的置信率大于95%(平均比值>2.0，方差<0.05)為條件進行篩選，共發現28個差異明顯的蛋白點，鑒定出15個蛋白質點。其中編號為254、256、651、211、205、620、635的7個蛋白質點下調，編號為634、618、624、540、613、201、537、605的8個蛋白質點上調(圖3、表2)。

2.2.1 6-磷酸葡糖胺脫氨酶(glucosamine-6-phosphate deaminase，GNPDA) 6-磷酸葡糖胺脫氨酶是一種催化酶[11]，在糖胺代謝中起重要作用，可以催化6-磷酸葡糖胺通過脫氨和異構2步反應生成6-磷酸果糖；6-磷酸葡糖胺脫氨酶對于N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)是否被利用最終進入糖酵解途徑起關鍵作用[12]。葡萄糖胺-6-磷酸脫氨酶(EC 3.5.99.6)是GlcNAc分解代謝途徑的終末酶[13]。

2.2.2 核糖體蛋白質S5(ribosomal protein S5) 核糖體蛋白質S5是核糖體蛋白質家族的重要成員，在核糖體中發揮重要作用[14]，其生物學過程與細胞質翻譯、核糖體小亞基組裝等有關。核糖體蛋白質S5是構成核糖體的重要成分，具有連接病毒和核糖體、調控細胞分化凋亡等核糖體外的功能，在蛋白質翻譯準確性，細胞內蛋白質生物合成以及tRNA轉運過程中發揮著必不可少的作用[15]，與mRNA結合、rRNA結合、核糖體的結構成分等分子功能有關。

2.2.3 絲/蘇氨酸蛋白質磷酸酶(Ser/Thr protein phosphatase) 絲/氨酸硫醇蛋白質酶往往在其酶的活性中心含有絲氨酸的羥基或半胱氨酸的巰基，如胰蛋白質酶、木瓜蛋白質酶、糜蛋白質酶、凝血酶、組織蛋白質酶、彈性蛋白質酶等，凡能與這些酶的活性中心結合、有效地降低其酶活性、又不使蛋白質酶變性的物質稱為絲氨酸硫醇蛋白質酶抑制劑或絲氨酸巰基蛋白質酶抑制劑。絲/蘇氨酸蛋白質磷酸酶屬于蛋白質磷酸酶家族中重要的細胞內調節蛋白質，能夠催化磷酸化絲氨酸或使蛋白質脫磷酸，并參與許多關鍵的生物學過程，在新陳代謝，DNA復制、轉錄、翻譯，細胞周期進程，信號傳導，細胞凋亡和胞外分泌等過程中均起重要作用[16]。

表2 樟腦處理彩絨革蓋菌差異蛋白質點的質譜鑒定

2.2.4 假定ssDNA結合蛋白質(putative ssDNA binding protein) 假定ssDNA結合蛋白(SSB)在細菌、古細菌和真核細胞的DNA復制、重組和修復中起著重要作用。

3 結論

本試驗采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術和質譜技術得到樟腦處理彩絨革蓋菌與對照的差異蛋白質表達圖譜，經分析得出以下結論：以2個樣品之間平均表達差異倍數大于2倍、且重復性好、差異表達變化明顯的蛋白質點15個，其中8個蛋白質點上調表達，7個蛋白質點下調表達；絲/蘇氨酸蛋白質磷酸酶等蛋白質的下調表達，說明白腐菌在新陳代謝，DNA復制、轉錄、翻譯，細胞周期進程，信號傳導，細胞凋亡和胞外分泌等方面也受到了抑制。本試驗結果可為新型木材防腐劑的研制以及闡明樟腦抑制白腐菌的分子機制提供參考。