1株好氧反硝化菌的篩選鑒定及固定化研究

宋漫利， 李 成， 劉春敬， 梁致齊， 李容臻， 謝建治

(河北農業大學資源與環境科學學院/河北省農田生態環境重點實驗室，河北保定 071001)

生物處理是污水處理中最常用也是最經濟有效的一種技術手段。生物處理構筑物中存在足量可高效降解污染物的微生物，能夠實現污染物的達標排放。但生物處理技術在寒冷地區冬季低溫時存在處理效果差、出水難以達標排放的問題[1]。污水處理廠一般采取降低污泥負荷、提高污泥濃度來確保出水水質，但這同時增加了運行費用[2]。Sudarno等研究發現，低溫時污水處理效果差的根本原因在于構筑物中低溫微生物數量和活性遠遠不夠，這強烈抑制了微生物的硝化、反硝化能力，最終導致冬季有機物降解效率和生物脫氮處理效果下降[3-4]。為了從根本上解決這一問題，應該從生物強化的角度提高污水處理構筑物中的耐冷微生物即耐冷菌的數量和活性，因此分離篩選出耐冷菌并應用于寒冷地區生活污水的處理這方面的研究工作非常重要。

將耐冷菌投加到污水處理系統中能夠提高污水處理效率，但存在菌體流失、與土著菌競爭劣勢、難以長效運行等問題[5]。為了解決這一問題，一些學者開展了固定化微生物應用于污水處理的研究工作，Rostron等采用固定化硝化菌處理氨態氮(NH3-N)廢水，硝化速率分別達到29.2、29.6 mg/(L·h)[6-7]。方明亮在SBR反應器中投加10 g固定化硝化細菌，在 13～14 ℃ 下低溫運行使氨態氮去除率提高20%[8]。張爽等將含耐冷菌的硝化污泥固定化后用于處理生活污水，低溫培養6 h后，氨態氮去除率為80%[9]。Yu等采用聚乙烯醇(PVA)分別與海藻酸鈉(SA)、Fe3O4納米材料、細菌纖維素固定硝化細菌和好氧反硝化細菌；3種材料固定脫氮菌的總氮去除率分別為66.04%、77.22%、69.81%[10]。Kim等用多孔纖維素作載體固定反硝化細菌，處理硝酸鹽污染的地下水，當水力停留時間為1 h時，硝態氮(NO3--N)去除率達 99.5%[11]。Song等用PVA和黃原膠混合固定人蒼白桿菌SY509(OchrobactrumanthropiSY509)，其脫氮效率是傳統包埋細胞的2.7倍[12]。

本研究從污水處理廠活性污泥中篩選出1株在低溫條件下具有較好脫氮性能的菌株，經初步鑒定為草假單胞菌(Pseudomonaspoae)，本試驗于2015年12月在筆者所在實驗室進行。分離出來的好養反硝化菌株共14屬37種，其中14種屬于假單胞菌，故假單胞菌被認為是最具備同步硝化反硝化應用潛力的菌株[13]。Nzilaa等曾報道從污水處理廠活性污泥中分離出若干菌株用于污水油脂的降解，其中1株菌為草假單胞菌，這是該菌株首次作為耐冷菌應用于污水處理[14]。本試驗開展了NL-4的PVA-SA包埋固定化優化及脫氮性能測試，并探討了NL-4固定化載體和游離菌受外部環境影響的程度，為該菌株的生物強化技術應用提供理論基礎。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗藥品

1.1.1 富集與分離培養基 反硝化細菌培養基：CH3COONa 3.0 g，KNO31.0 g，KH2PO40.1 g，NH4Cl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，CaCl2·2H2O 0.07 g，微量元素溶液2 mL，蒸餾水1 L。微量元素：FeCl3·6H2O 1.5 g，CuSO4·5H2O 0.03 g，MnCl2·4H2O 0.12 g，ZnSO4·7H2O 0.12 g，Na2MoO4·2H2O 0.06 g，H3BO30.15 g，KI 0.03 g，CoCl2·6H2O 0.15 g，蒸餾水1 L。LB培養基(液體)：牛肉浸膏5.0 g，氯化鈉5.0 g，蛋白胨 10.0 g，蒸餾水1 L。培養基在高壓鍋121 ℃中滅菌30 min后使用，調pH值至7.0～7.2，操作均為無菌操作。固體培養基制備是在液體培養基中添加20 mg/mL的瓊脂粉。

1.1.2 人工配制污水 本試驗涉及去除特性的研究，均用人工污水，配方是以1.5 g/L葡萄糖為碳源，0.13 g/L氯化銨、0.2 g/L硝酸鉀為氮源，0.042 g/L磷酸二氫鉀為磷源，再添加其他微量元素。

1.2 耐冷菌的篩選與鑒定

1.2.1 初篩 菌源選取河北省張家口市崇禮污水處理廠SBR反應池活性污泥。取 10 mL污泥加入裝有90 mL無菌水帶玻璃珠的三角瓶中，振蕩30 min。取上清液10 mL，加入到90 mL液體培養基中，在10 ℃、150 r/min下振蕩培養7 d，然后取 10 mL 接種到90 mL新液體培養基中繼續培養7 d，如此進行4輪富集。最終取0.1 mL最終培養液，涂布法接種于對應固體培養基上，10 ℃下恒溫培養。當出現菌落時，挑取單個菌落，接種于液體培養基，10 ℃下搖床培養。如此反復純化，直至分離出單菌株[15]。

1.2.2 復篩 把D600 nm值為0.5的耐冷菌菌懸液按10%接種量接種于反硝化培養基中，于10 ℃、120 r/min下振蕩培養 24 h，離心后測定硝態氮濃度，選擇硝態氮去除率最高的耐冷菌進行下步研究。

1.2.3 鑒定 采用堿裂解法提取耐冷菌DNA，然后進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以27F/1492R為通用引物進行16S rDNA的PCR擴增，PCR產物純化后測序，并將測定結果在NCBI上進行BLAST序列比對，對篩選的耐冷菌進行初步鑒定。

1.3 PVA-SA包埋固定化耐冷菌制備方法

以PVA、SA為包埋材料，硼酸、氯化鈣為交聯劑，將PVA和SA混合，加入80 mL蒸餾水浸泡過夜，次日高溫滅菌，冷卻至30 ℃左右后加入菌懸液，用無菌水定容至 100 mL，攪拌均勻，用蠕動泵從20 cm高處將其緩慢勻速滴加到磁力攪拌器上盛氯化鈣飽和硼酸的溶液中(用Na2CO3調pH值6.7左右)，靜置1 h，使固定化顆粒成形，然后于4 ℃冰箱中放置24 h，再轉入0.5 mol/L Na2SO4溶液進一步對凝膠顆粒進行交聯[16-17]。最后，用無菌水和生理鹽水各沖洗2次，于4 ℃冰箱中保存備用。

1.4 PVA-SA包埋固定化耐冷菌正交試驗設計

為了優化耐冷菌最佳固定化條件，設計4因素3水平正交試驗。4個試驗因素分別為SA含量、PVA含量、CaCl2含量和包菌量，各試驗因素分別設置3個水平，按L9(34)正交表設計正交試驗(表1)，固定化小球物理特性的考查指標主要包括密度、直徑、成球性、機械性能、傳質性和膨脹系數等。

表1 正交試驗設計

1.5 降解特性測定方法

1.5.1 耐冷菌降解特性測定 待測菌種統一配制成菌懸液，相應接菌量接種到裝有已滅菌人工污水的錐形瓶中，于 150 r/min下恒溫培養24 h。以未接種菌株的人工污水為空白對照組，試驗組設3組平行試驗。水樣4 000 r/min離心 10 min，取上清液放置冰箱保存測定。

1.5.2 固定化載體降解性能測定試驗 與測定單菌降解特性所用的同量菌懸液做成固定化載體，把所做的固定化小球接種到裝有已滅菌人工污水的錐形瓶中，于150 r/min、10 ℃下恒溫培養24 h。以未加固定化小球的人工污水為空白對照組，試驗組設3組平行試驗。水樣4 000 r/min離心10 min，把取出固定化顆粒，取上清液放置冰箱保存測定。

1.6 分析項目與測定方法

NH3-N含量，納氏試劑分光光度法；NO3--N含量，紫外分光光度法；耐冷菌及固定化顆粒形貌，KYKY-2800B型數字化掃描電子顯微鏡。

2 結果與分析

2.1 耐冷菌NL-4分離鑒定

通過連續富集培養和反復分離純化，篩選出1株在10 ℃培養條件下生長性能良好并對NH4+-N和NO3--N具有較好去除性能的耐冷菌NL-4。該菌株在10 ℃培養條件下的平板培養特征及形態學特征如表2所示，細胞形貌如圖1所示。采用光電比濁法測定這種菌在10 ℃下的生長曲線(圖2)，菌株生長周期為36 h左右，在6～24 h進入對數增長期，世代時間是2.74 h。

表2 NL-4平板培養特征及形態學特征

提取耐冷菌DNA后，以27F/1492R為通用引物進行16S rDNA的PCR擴增，PCR產物16S rDNA區序列長1 168 bp，測序結果提交GenBank獲得登錄號，通過Blast進行多序列匹配比對，用MEGA7采用Neighbor-Joining方法進行分子系統學分析并構建系統發育樹(圖3)，展示菌株遺傳多樣性和菌株間的親緣關系。比對結果表明，耐冷菌NL-4與假單胞菌屬中的草假單胞菌(Pseudomonaspoae)聚于同一分支，同源性高達100%，結合形態觀察，初步鑒定該菌株為假單胞菌屬的草假單胞菌。該菌已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號為13450；已申請專利，專利號為201710049110.0。

2.2 固定化NL-4載體制備條件優化試驗研究

由表3可知，根據正交試驗NO3--N去除率初步確定組合A2B3C1D2為最佳固定化制備條件。但極差分析后，有了不一樣的結果。因素之間NO3--N去除率的極差越大，說明對去除率影響越大，從表3可知影響程度為PVA含量>SA含量>包菌量>CaCl2含量。各因素去除率最佳的水平，是根據各水平的均值大小決定，均值越大，該水平越佳，所以各素的最佳水平分別是ⅡA、ⅢB、ⅡC、ⅡD，所以理論最優組合為A2B3C2D2。對理論的最優組合在相同條件下，考察 NO3--N去除率為91.25%，低于初步確定組合的去除率，所以選定A2B3C1D2為下步制備固定化載體的最優條件，即SA含量1%、PVA含量12%、CaCl2含量1%、包菌量10%。A2B3C1D2制備的固定化小球外觀如圖4所示。

表3 固定化正交試驗結果

注：表中A、B、C、D分別代表SA、PVA、CaCl2的質量分數及包菌量4個因子。在計算均值過程中，表中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示水平，j表示因素，如ⅠA表示因素A在因水平為1即SA的含量為0.5%時，各組試驗的NO3--N去除率均值；R表示各因素NO3--N去除率的極差值。

2.3 NL-4及其固定化載體對污水中污染物去除性能

NL-4和固定化后對廢水中NH3-N和NO3--N去除效果如圖5所示。可知在整個培養周期內NL-4固定化后對污水脫氮效率均高于游離菌，隨著培養時間的延長，兩者的去除效率變化趨勢基本一致。由圖5-a可知，NL-4對NH3-N的去除比較平緩，培養21 h后，反應趨于穩定。24 h 后，固定化對NH3-N去除率為82.54%，與游離菌相比提高了14.49%。由圖5-b可知，NL-4無論固定化和游離菌均表現出較高的NO3--N去除率，培養3 h后對 NO3--N的去除率已經分別達到87.38%和86.38%。培養24 h后，固定化NO3--N去除率達99.54%，提高了1.4百分點。

2.4 NL-4及其固定化載體低溫存儲后去除性能變化

NL-4固定化載體和游離菌均放置在4 ℃冰箱中保藏，保藏過程中不定時取出，分別接入人工污水中，在10 ℃下進行培養，測定對廢水中的NH3-N和NO3--N的去除效果，結果如表4所示。NL-4固定化載體保藏后對NH3-N和NO3--N去除效果的穩定性明顯高于游離菌。隨著低溫保藏時間不斷延長，前30 d固定化載體對NH3-N和 NO3--N去除率無明顯變化；保藏45 d后，NO3--N去除率開始低于90%，NH3-N去除率低于70%，但60 d后 NH3-N和 NO3--N 去除率仍可達80%和60%以上。保藏前15 d對游離菌去除性能的影響較小，但隨著保藏時間的延長，游離菌對NH3-N和NO3--N去除率急劇下降；在保藏60 d后，去除率分別低于30%和20%。綜上所述，低溫保藏后，固定化載體可以保持對NH3-N和NO3--N去除性能的穩定性。

2.5 溫度和酸堿度對NL-4硝化反硝化性能的影響

分別將10%游離菌和等量菌制備的固定化載體接種于人工污水(pH值設置5個梯度：5～9)中，在10 ℃、150 r/min下恒溫培養。不同pH值對游離菌和固定化載體去除性能的影響如圖6所示，NL-4游離菌和固定化載體在中性或偏堿性條件下對NH3-N和NO3--N去除效果較好，固定化載體對NH3-N去除效果要明顯優于游離菌，兩者對NO3--N的去除效果無明顯差異，在pH值=8時固定化載體對NH3-N去除率最高為85.1%。在偏酸性條件下，由于不適宜的酸堿環境會降低微生物增殖速度和酶活性，因此兩者對NH3-N和NO3--N去除效果均降低，但固定化載體硝化反硝化能力影響程度較小。這主要因為游離菌與酸性環境直接接觸，影響其生長繁殖，固定化后耐冷菌受包埋材料的保護，內部環境受外部環境影響較小。

表4 保藏時間對氨氮和硝氮去除率的影響

分別將10%游離菌和等量菌制備的固定化載體接種于人工污水，設置溫度5個梯度(5～40 ℃)，于150 r/min中恒溫培養。不同溫度對游離菌和固定化載體去除性能的影響如圖7所示，NL-4游離菌和固定化載體在15 ℃或20 ℃環境下NH3-N和NO3--N去除效果較好，且兩者去除效果無較大差異；在20 ℃時，固定化載體NH3-N和NO3--N去除率最高，分別為88.6%、100%，游離菌NH3-N和NO3--N去除率最高，分別為89.9%和100%；當溫度更低或更高時，兩者對NH3-N和NO3--N去除效果均降低，但固定化載體影響程度較小。主要因為溫度影響微生物功能酶活性和細胞繁殖[18]，在微生物處于適宜生長的環境下時，游離菌對外部環境有較好的敏感性，可以很快生長繁殖，而固定化后對環境的感知有延后性，導致微生物數量低于游離菌。在溫度較低時，耐冷菌生長繁殖速度降低；而溫度較高時，細菌細胞酶遭破壞，生長速率同樣降低。由于包埋固定化載體有很好的隔層保溫作用，給內部微生物適應外部環境緩沖的時間，所以在pH值和溫度變化上，表現出較好的適應性和較高的抗沖擊能力。

2.6 NL-4固定化載體內部形貌特征分析

為了考察NL-4在固定化載體內的存活狀態及穩定性，采用SEM對比分析NL-4固定化顆粒在處理污水前后的內部形貌。由圖8可看出，固定化內部由大量網狀結構連接而成，空隙較多，且孔徑分布均勻。耐冷菌菌體貫穿在顆粒的網絡結構中，載體內部空隙較多，質地疏松，有利于微生物附著生長以及基質物質的運輸與擴散。對比處理污水前后的固定化載體內部特征可以看出，固定化顆粒在污水處理后仍能夠保持相當數量的微生物，沒有出現菌體流失或大量死亡的現象。處理污水后，顆粒內部存在一些絮狀物質，這可能是污水處理過程中的代謝產物，由于數量不多，不會影響菌體生長繁殖和物質運輸。

3 結論

耐冷菌NL-4為革蘭氏陰性菌，呈桿狀，菌落顏色為嫩黃色，圓形，中凸起，表面光滑，不透明。分子生物學鑒定確定為假單胞菌(Pseudomonassp.)。耐冷菌固定化最佳條件為：固定化載體SA含量1%，PVA含量12%、CaCl2含量1%、包菌量10%。

耐冷菌NL-4在低溫條件下有較好的脫氮效果，培養 24 h 后，對污水中NH3-N和NO3--N去除率分別是 68.05% 和98.94%。采用PVA-SA包埋固定化方法固定化NL-4后，對污水中NH3-N和NO3--N的去除效率比游離菌分別提高了14.49%和1.4%。

微生物固定化將細胞固定于有限空間中，使微生物保持活性和去除性能穩定性。固定化載體可以重復使用，并可保藏待用，在4 ℃保藏60 d后，比游離菌保持對污染物中 NH3-N和NO3--N去除性能的穩定性較強。

pH值=8時，固定化載體NH3-N和NO3--N去除率最高為85.1%和100%；在20 ℃時，固定化載體NH3-N和NO3--N 去除率最高分別為88.6%和100%，游離菌NH3-N和NO3--N去除率最高分別為89.9%和100%。當外部環境pH值和溫度波動時，固定化載體表現出更好的適應性和抗沖擊能力。