對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼魚(yú)的毒性效應(yīng)研究

藺鵬飛，苗晶晶,，潘魯青，林雨霏，武江越

1. 中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266003 2. 國(guó)家海洋局海洋減災(zāi)中心，北京 100194

對(duì)二甲苯是一種重要的工業(yè)原料，被廣泛用于農(nóng)藥、塑料和纖維合成等行業(yè)。2015年，全球?qū)Χ妆侥戤a(chǎn)量達(dá)3 696萬(wàn)噸，其中中國(guó)的全年產(chǎn)量達(dá)到882萬(wàn)噸，占全球?qū)Χ妆侥戤a(chǎn)量的23%。對(duì)哺乳動(dòng)物的研究表明，對(duì)二甲苯具有神經(jīng)毒性、遺傳毒性、胚胎毒性以及致畸作用[1-3]，目前對(duì)二甲苯已被國(guó)際海事組織列入高泄漏風(fēng)險(xiǎn)危險(xiǎn)化學(xué)品名單[4]。2007年，位于中國(guó)珠海港恒基達(dá)鑫化工碼頭的一艘外籍工船發(fā)生對(duì)二甲苯泄漏，造成約計(jì)400升的對(duì)二甲苯傾入海中[5]。目前對(duì)二甲苯對(duì)水生生物的毒性作用研究較少。范亞威和周啟星[6]研究了二甲苯對(duì)斑馬魚(yú)的急性致死效應(yīng)，然而海洋魚(yú)類(lèi)和淡水魚(yú)類(lèi)對(duì)二甲苯的敏感性可能存在較大的區(qū)別，而對(duì)二甲苯對(duì)海洋魚(yú)類(lèi)的毒性效應(yīng)研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此亟需了解對(duì)二甲苯等危險(xiǎn)化學(xué)品對(duì)海洋生物特別是經(jīng)濟(jì)種類(lèi)的毒性作用，為海洋危險(xiǎn)化學(xué)品泄露的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)。

近年來(lái)我國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，截至2012年為止我國(guó)海水養(yǎng)殖面積達(dá)2 180 927公頃，養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)1 643.81萬(wàn)噸，海水魚(yú)類(lèi)產(chǎn)量超過(guò)100萬(wàn)噸[7]。褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)是名貴的冷溫性海水魚(yú)類(lèi)，由于其經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，近10年來(lái)逐漸成為我國(guó)黃渤海海域的重要增養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)品種，同時(shí)也是毒理學(xué)研究和檢測(cè)的常用受試生物[8]。二甲苯包括鄰二甲苯、間二甲苯和對(duì)二甲苯3種同分異構(gòu)體，本研究選擇應(yīng)用最為廣泛的對(duì)二甲苯開(kāi)展研究，通過(guò)急性和亞慢性暴露試驗(yàn)，研究了其對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)的致死效應(yīng)與生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，通過(guò)測(cè)定對(duì)二甲苯脅迫下褐牙鲆幼魚(yú)肝臟的脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA損傷效應(yīng)、腦組織中乙酰膽堿酯酶活性(AchE)、血細(xì)胞總數(shù)變化以及血清中溶菌酶活力等評(píng)價(jià)指標(biāo)，解析對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆的遺傳毒性、神經(jīng)毒性以及免疫毒性效應(yīng)，進(jìn)而全面系統(tǒng)地了解對(duì)二甲苯對(duì)海洋魚(yú)類(lèi)的毒性作用機(jī)制，為對(duì)二甲苯的海洋生態(tài)毒理評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

試驗(yàn)所用的褐牙鲆幼魚(yú)取自煙臺(tái)海陽(yáng)市黃海水產(chǎn)養(yǎng)殖廠。實(shí)驗(yàn)魚(yú)類(lèi)的規(guī)格分為2種，一種是孵化后60 d的幼魚(yú)，平均體長(zhǎng)為4～6 cm，平均體重為(4.2±0.3) g，被用于急性毒性試驗(yàn)。另一種規(guī)格為孵化后6個(gè)月的幼魚(yú)，平均體長(zhǎng)為6～8 cm，平均體重為(6.7±0.6) g，被用于生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和亞慢性毒性試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)魚(yú)的10 d暫養(yǎng)條件為：溶解氧7.0～7.5 mg·L-1，鹽度33～35，溫度(18±1) ℃，pH 8.1。暫養(yǎng)期間投喂通威牌魚(yú)用飼料，每天投喂的量為實(shí)驗(yàn)用魚(yú)體重的3%。

1.2 急性毒性試驗(yàn)

急性毒性試驗(yàn)參考OECD (Organization for Economic Cooperation and Development)化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則進(jìn)行[9]，共設(shè)置5個(gè)染毒濃度和1個(gè)空白對(duì)照，每組設(shè)置3個(gè)平行。染毒濃度分別為20、40、80、160和320 mg·L-1。本實(shí)驗(yàn)采用半靜態(tài)試驗(yàn)方法，每24小時(shí)更換95%的試驗(yàn)液，試驗(yàn)期間持續(xù)充氣并盡可能保持水槽處于密封狀態(tài)。對(duì)二甲苯暴露實(shí)驗(yàn)條件與暫養(yǎng)期間保持一致。在暴露96 h期間，各處理組隨機(jī)6次取水樣測(cè)定水體中對(duì)二甲苯濃度，以6次平均值表示對(duì)二甲苯的實(shí)際濃度。水體中對(duì)二甲苯含量測(cè)定參考頂空-毛細(xì)管柱氣相色譜法(GB/T-5750.8—2006)[10]，采用Agilent 6890N型氣相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，毛細(xì)管色譜柱為FFAP 25 m ×0.32 mm；載氣為高純氮；燃?xì)鉃榧儦洌贿M(jìn)樣溫度為150 ℃；柱溫為50 ℃，檢測(cè)器溫度為160 ℃；線流速為30 cm·s-1；分流比為10:1；進(jìn)樣量為800 μL。魚(yú)類(lèi)死亡的判斷標(biāo)準(zhǔn)為用玻璃棒觸碰尾部沒(méi)有任何反應(yīng)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用概率單位分析法求出96 h的半致死濃度(LC50)及其95%置信區(qū)間。

1.3 28 d慢性暴露實(shí)驗(yàn)

1.3.1 28 d慢性暴露試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)急性毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取96 h-LC50的1/20、1/40和1/80作為3個(gè)亞慢性毒性試驗(yàn)暴露濃度，即2.3、4.6和9.2 mg·L-1，每組設(shè)置3個(gè)平行，試驗(yàn)條件與急性毒性試驗(yàn)一致。在試驗(yàn)開(kāi)始之前和暴露28 d之后每組取8尾受試魚(yú)測(cè)量體重，用于計(jì)算魚(yú)類(lèi)的增重率和特定生長(zhǎng)率的變化[11]。增重率和特定生長(zhǎng)率的計(jì)算公式如下：增重率(%)=(W2-W1)×100/W1，特定增長(zhǎng)率(%)=100×[(lnW2-lnW1)/T]。其中W2和W1分別表示結(jié)束和開(kāi)始時(shí)的體重，T代表染毒暴露的時(shí)間。

28 d慢性暴露實(shí)驗(yàn)期間分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后的0、7、14、21和28 d時(shí)取樣用于亞慢性毒性指標(biāo)的測(cè)定。取樣時(shí)從各個(gè)水槽內(nèi)隨機(jī)選取8尾褐牙鲆幼魚(yú)，用2 mL針筒于尾靜脈處取血，并立即進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)[12]。剩余血液樣品于4 ℃下，經(jīng)2 000 r·min-1離心分離，收集血清，于-80 ℃冷凍保存，用于溶菌酶活力測(cè)定。取血后迅速解剖魚(yú)體并取出肝臟和魚(yú)腦組織于液氮中冷凍，冷凍保存于-80 ℃用于脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA損傷和乙酰膽堿酯酶(AchE)活性測(cè)定。

1.3.2 生理生化指標(biāo)測(cè)定

脂質(zhì)過(guò)氧化的方法采用測(cè)定次級(jí)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量的方法，根據(jù)Wills的方法[13]稍加改進(jìn)：將組織用體積為1∶19的勻漿緩沖液(pH=7.7, Na2HPO4·12H2O 0.125 mol·L-1, K2HPO4·12H2O 0.125 mol·L-1, Na2EDTA 0.05 mol·L-1)于冰浴中勻漿，勻漿后4 ℃、1 200 g離心30 min，收集上清液用于實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定。取200 μL上清液，加入100 μL 20% TCA(包含1 mmol·L-1FeSO4)和200 μL 0.67%硫代巴比妥酸試劑，在90 ℃水浴10 min，3 000 r·min-1離心5 min，取200 μL上清液在530 nm讀取吸光值OD530，單位為nmol·mg-1。蛋白質(zhì)含量測(cè)定以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物，采用Bradford的方法[14]測(cè)定。

DNA堿解旋的測(cè)定方法參照Ching的方法[15]利用熒光分光光度計(jì)定量組織中雙鏈和單鏈DNA含量，DNA的完整性用F值表示，計(jì)算公式為F=(XauDNA-XssDNA)/(XdsDNA-XssDNA)，式中X為熒光值，dsDNA為雙鏈DNA，ssDNA為單鏈DNA，auDNA為堿解旋后的DNA。

AChE的活性測(cè)定采用Ellman的方法[16]，原理是碘化硫代乙酰膽堿被AChE分解為乙酸和硫代膽堿，硫代膽堿與DTNB生成一種黃色絡(luò)合物，在412 nm處顯色。取100 μL的磷酸鹽緩沖液中加入50 μL酶液，于35 ℃保溫20 min。然后依次加入50 μL碘化硫代乙酰膽堿(75 mmol·L-1)、100 μL DTNB溶液(20 mmol·L-1)，置于96孔酶標(biāo)板上迅速混合，在波長(zhǎng)為412 nm處讀取吸光值。蛋白質(zhì)含量測(cè)定以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物，采用Bradford的方法[14]測(cè)定。酶活力定義為每毫克蛋白AChE的活性單位數(shù)表示。

溶菌酶活力的測(cè)定采用Hultmark方法[17]，以溶壁微球菌凍干粉為底物，用pH=6.4的磷酸鉀緩沖液配成底物懸液，取200 μL該懸液與20 μL待測(cè)液血清于96孔酶標(biāo)板中混勻，于570 nm處測(cè)量吸光度A1，28 ℃下水浴30 min終止反應(yīng)，測(cè)定吸光度A2。溶菌酶活力(U·mL-1)計(jì)量方式采用(A1-A2)/A2。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以3個(gè)平行組的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means ± S.D)表示。用數(shù)據(jù)軟件SPSS 17.0 進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan檢驗(yàn)，P<0.05代表差異顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Results)

2.1 致死和生長(zhǎng)

試驗(yàn)期間測(cè)定的各濃度組水體中對(duì)二甲苯的濃度分別為(18.25±0.5)、(34.52±0.5)、(72.63±0.8)、(147.24±0.6)和(303.77±0.5) mg·L-1。對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)的96 h-LC50是45.7 (33.516～59.741) mg·L-1。回歸方程y=-4.328+2.607x。試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)照組沒(méi)有死亡現(xiàn)象，其中20 mg·L-1染毒組的死亡率為25%，320 mg·L-1染毒組褐牙鲆幼魚(yú)的死亡率為100%。

如圖表1為褐牙鲆幼魚(yú)經(jīng)過(guò)28 d暴露后，增重率和特定生長(zhǎng)率的抑制情況。2.3、4.6和9.2 mg·L-1暴露組的增重率和特定生長(zhǎng)率與對(duì)照組相比受到顯著抑制(P<0.05)。其中9.2 mg·L-1的暴露組中褐牙鲆幼魚(yú)的生長(zhǎng)抑制達(dá)到最高，增重率和特定增長(zhǎng)率分別為對(duì)照組的21.27%和23.07%。

表1 對(duì)二甲苯暴露28 d后對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)Table 1 Effects of p-xylene on growth of P. olivaceusafter 28 days of feeding

注：數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means ± S.D)表示，同列中不同字母表示2組間差異顯著(P< 0.05)。Note: Data are presented as means ± S.D. Means in the same column with different letters differ significantly from each other (P< 0.05).

2.2 對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)肝臟的脂質(zhì)過(guò)氧化與DNA損傷效應(yīng)

經(jīng)過(guò)不同濃度和時(shí)間的對(duì)二甲苯暴露后，實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝組織的MDA含量變化如圖1所示：在7 d時(shí)，2.3 mg·L-1濃度組中MDA含量與對(duì)照組相比并無(wú)顯著性差異(P<0.05)。從14 d開(kāi)始時(shí)，各個(gè)濃度組MDA含量與對(duì)照組相比均表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)，各濃度組的MDA含量整體呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)。2.3 mg·L-1和4.2 mg·L-1染毒濃度的褐牙鲆幼魚(yú)肝臟中MDA含量均在14 d時(shí)達(dá)到最高值，其含量分別為對(duì)照組的175.11%和175.85%。在9.2 mg·L-1染毒組中觀察到，MDA含量在21 d時(shí)達(dá)到最高值，其含量約占對(duì)照組的197.71%。

圖1 對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化影響Fig. 1 Effects of p-xylene on lipid peroxide (MDA) levels in fish liver

圖2 對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)肝臟DNA損傷的影響Fig. 2 Effects of p-xylene on DNA damage (F value) levels in fish liver

對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)DNA堿解旋的影響如圖2所示：對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)肝臟DNA損傷存在時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著暴露濃度和染毒時(shí)間的增加，DNA損傷增加。7 d時(shí)各濃度組與對(duì)照組相比并沒(méi)有顯著性變化(P<0.05)，28 d時(shí)，各濃度組與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)，分別為對(duì)照組的75.92%、64.81%和61.11%。

2.3 對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)腦組織AChE活力的影響

對(duì)二甲苯暴露質(zhì)量濃度與AChE活性之間具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖3)：隨著染毒時(shí)間和暴露濃度的增加，2.3、4.6和9.2 mg·L-1的暴露組的AChE活性與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)，并在28 d時(shí)達(dá)到最小值，分別是對(duì)照組的78.11%、65.11%和57.40%。

圖3 對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)腦乙酰膽堿酯酶活性的影響Fig. 3 Effects of p-xylene on brain acetylcholinesterase (AchE) of Paralichthys olivaceus

2.4 對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)的總血細(xì)胞數(shù)量和溶菌酶活力的影響

對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)的總血細(xì)胞數(shù)量影響顯著(P<0.05)，7 d時(shí)各濃度組總血細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，14 d時(shí)9.2 mg·L-1染毒組的血細(xì)胞數(shù)量顯著降低并達(dá)到最低值，血細(xì)胞數(shù)量是對(duì)照組的68.49%。14 d和21 d時(shí)2.3和4.6 mg·L-1濃度組的血細(xì)胞數(shù)量仍顯著高于對(duì)照組，而9.2 mg·L-1濃度組的血細(xì)胞數(shù)量低于對(duì)照水平(圖4)。對(duì)二甲苯能夠顯著降低褐牙鲆幼魚(yú)血清溶菌酶活力(P<0.05)，隨著染毒時(shí)間增加(14～28 d)，各染毒組(2.3，4.2和9.2 mg·L-1)溶菌酶活力顯著下降，而對(duì)照組在試驗(yàn)期間并無(wú)顯著性變化。2.3、4.6和9.2 mg·L-1染毒組分別于21 d和28 d時(shí)達(dá)到最小值，分別為對(duì)照組的60.71%、73.91和81.19%(圖5)。

圖4 對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)血細(xì)胞總數(shù)的影響Fig. 4 Effects of p-xylene on total hemocyte counts of P. olivaceus

圖5 對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)血清中溶菌酶活力的影響Fig. 5 Effects of p-xylene on lysozyme activity of P. olivaceus

3 討論(Discussion)

3.1 對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)存活和生長(zhǎng)的影響

已有研究表明，二甲苯對(duì)花條鱸魚(yú)(Moronesaxatilis)、黑頭呆魚(yú)(Pimephalespromelas)、網(wǎng)紋鳉(Poeciliareticulata)、虹鱒魚(yú)(Oncorhynchusmykiss)和鯽魚(yú)(Carassiusauratus)的LC50分別為2.0 μL·L-1(96 h)、8 870 μg·L-1(96 h)、8 800 μg·L-1(96 h)、2 600 μg·L-1(96 h)和18 000 μg·L-1(24 h)[18-21]。本實(shí)驗(yàn)研究獲得對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)的96 h-LC50值為45.7 mg·L-1。由此表明6種魚(yú)類(lèi)對(duì)對(duì)二甲苯的敏感度依次為花條鱸魚(yú)>虹鱒魚(yú)>網(wǎng)紋鳉>黑頭呆魚(yú)>鯽魚(yú)>褐牙鲆。根據(jù)化學(xué)物質(zhì)對(duì)魚(yú)類(lèi)毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(國(guó)家環(huán)保局水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法編委會(huì)，2002)，二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)的毒性屬于中等毒性，與范亞威和周啟星[6]對(duì)斑馬魚(yú)的研究結(jié)果一致。目前關(guān)于對(duì)二甲苯對(duì)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)抑制的研究還未有報(bào)道，本研究表明，2.3、4.6和9.2 mg·L-1這3個(gè)染毒組均能顯著抑制牙鲆幼魚(yú)體重的增加，并降低其增重率和特定增長(zhǎng)率，這表明暴露于對(duì)二甲苯(>2.3 mg·L-1)28 d對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用。

3.2 對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)的肝臟毒性

二甲苯在哺乳動(dòng)物肝臟內(nèi)代謝主要通過(guò)一個(gè)甲基的氧化進(jìn)行，通過(guò)細(xì)胞色素CYP450 2E1將污染分子轉(zhuǎn)化成甲基芐醇，進(jìn)一步通過(guò)生物轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸[22]。在這一代謝過(guò)程中，組織中的氧化自由基增加，可誘發(fā)生物體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA鏈斷裂等氧化損傷[23]，因此查明這些生物標(biāo)志物的活性變化可反映氧化應(yīng)激的存在，常被作為環(huán)境污染脅迫的生物標(biāo)志物。

丙二醛(MDA)含量是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的分解產(chǎn)物，MDA的產(chǎn)生主要是由于未經(jīng)抗氧化酶轉(zhuǎn)化的超氧陰離子及其他自由基對(duì)細(xì)胞膜多不飽和酸進(jìn)行攻擊，產(chǎn)生了LOOH等過(guò)氧化物所致，其含量能夠反映脂質(zhì)過(guò)氧化的水平[24]。Jajte等[25]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)二甲苯的脂質(zhì)過(guò)氧化作用是其誘導(dǎo)小鼠肝臟毒性的主要途徑。本實(shí)驗(yàn)研究表明，2.3 mg·L-1濃度組肝臟中的MDA含量在7 d時(shí)與對(duì)照組并無(wú)顯著差異，14 d以后各濃度組的MDA含量均顯著增加；在9.2 mg·L-1處理組中觀察到，MDA含量在21 d時(shí)達(dá)到最高值。已有研究表明，對(duì)二甲苯能夠顯著影響大彈涂魚(yú)肝臟中的MDA含量，且肝臟中MDA的產(chǎn)生主要是由于谷胱甘肽的再生量不足以完全清除LOOH，使過(guò)氧化物再經(jīng)分子內(nèi)的環(huán)化、裂解等步驟產(chǎn)生[26]。在本研究中對(duì)二甲苯暴露7 d時(shí)未產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化損傷表明短期暴露機(jī)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)能夠去除多余的活性氧(ROS)，因而氧自由基并未對(duì)肝臟細(xì)胞造成明顯損傷，然而高濃度組在21 d時(shí)MDA含量顯著增高表明高濃度長(zhǎng)期的暴露會(huì)導(dǎo)致褐牙鲆幼魚(yú)肝臟中的脂質(zhì)過(guò)氧化增加，氧自由基對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)的肝臟細(xì)胞造成明顯的毒性作用。

已有研究表明二甲苯暴露能夠?qū)Σ溉閯?dòng)物和人類(lèi)造成DNA損傷。呂丹瑜等[27]的研究表明，二甲苯可引起妊娠母鼠外周血有核細(xì)胞DNA損傷。倪祖堯和逢兵[28]研究發(fā)現(xiàn)接觸苯、甲苯和二甲苯的工人外周血細(xì)胞會(huì)造成DNA損傷。但是目前對(duì)二甲苯對(duì)水生生物，尤其是魚(yú)類(lèi)的遺傳毒性作用所知甚少。本實(shí)驗(yàn)中褐牙鲆幼魚(yú)肝臟F值在7 d時(shí)各濃度組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，Rogers等[29]對(duì)小鼠的研究同樣也表明了短期對(duì)二甲苯的暴露不能對(duì)小鼠造成DNA損傷，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。因此作者認(rèn)為對(duì)二甲苯暴露并不能在短時(shí)間內(nèi)對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)肝臟造成DNA損傷。另外本實(shí)驗(yàn)研究顯示在14、21和28 d時(shí)，各濃度組均與對(duì)照組顯著性差異(P<0.05)，且均有良好的時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系。由此說(shuō)明對(duì)二甲苯長(zhǎng)期(28 d)暴露能夠引起幼魚(yú)肝臟的DNA損傷。對(duì)于苯類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生DNA損傷的機(jī)制，Andreoli等[30]的研究表明，苯在肝臟中經(jīng)細(xì)胞色素P4502E1酶的催化作用，代謝成酚的代謝物，這些產(chǎn)物經(jīng)氧化還原產(chǎn)生羥自由基等活性氧物質(zhì)，從而導(dǎo)致DNA鏈斷裂；Niaz等[31]的研究表明對(duì)二甲苯屬于高脂溶性有機(jī)溶劑，能夠使細(xì)胞膜破裂，產(chǎn)生DNA裂解酶，最終造成DNA鏈斷裂。由本實(shí)驗(yàn)得到的對(duì)二甲苯導(dǎo)致的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷結(jié)果，作者推測(cè)對(duì)二甲苯所致的氧化損傷可能是造成褐牙鲆幼魚(yú)DNA損傷的主要途徑。

3.3 對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)的腦神經(jīng)毒性

AChE是與神經(jīng)活動(dòng)密切相關(guān)的重要物質(zhì)，是表征污染物神經(jīng)毒性的重要生物標(biāo)志物[32]。Sandahl等[33]的研究發(fā)現(xiàn)，AChE活性抑制和魚(yú)類(lèi)的游泳以及攝食能力具有明顯的正負(fù)相關(guān)性。Le Bris等[34]和Sturm等[35]也證明抑制AChE活性，能夠降低魚(yú)類(lèi)的攝食活動(dòng)，進(jìn)而影響?hù)~(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)。本文結(jié)果表明，對(duì)二甲苯(2.3～9.2 mg·L-1)作用下能夠顯著誘導(dǎo)褐牙鲆幼魚(yú)腦組織內(nèi)AChE活性，且AChE酶活力下降與染毒濃度以及暴露時(shí)間與具有明顯的正負(fù)相關(guān)性。因此作者認(rèn)為對(duì)二甲苯的神經(jīng)毒性可能是造成的褐牙鲆幼魚(yú)的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)的重要原因。對(duì)二甲苯具有揮發(fā)性和脂溶性高等特征，其穿過(guò)血腦屏障后能改變相鄰細(xì)胞之間的滲透性和神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)功能，甚至促使細(xì)胞膜和膜質(zhì)中的脂類(lèi)物質(zhì)溶解，從而誘發(fā)神經(jīng)毒性[36]。顏士勇等[37]的研究證實(shí)，二甲苯對(duì)大鼠神經(jīng)細(xì)胞具有直接的毒性作用。本研究中長(zhǎng)期暴露下對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)肝臟造成了顯著的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，這表明對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)的長(zhǎng)期毒性效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致大量活性氧自由基無(wú)法清除。由于腦組織內(nèi)抗氧化防御酶系表達(dá)量較低，極易受到自由基的攻擊[38]，因此對(duì)二甲苯的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷也可能造成褐牙鲆幼魚(yú)的神經(jīng)毒性，而其對(duì)褐牙鲆腦組織的氧化損傷效應(yīng)有待于進(jìn)一步的研究。

3.4 對(duì)二甲苯對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)的免疫毒性

血液指標(biāo)被廣泛地用于評(píng)價(jià)魚(yú)類(lèi)的健康狀況以及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，同時(shí)也作為毒理學(xué)指標(biāo)用來(lái)反映污染物對(duì)魚(yú)類(lèi)免疫水平的影響[39]。魚(yú)類(lèi)血細(xì)胞數(shù)量變化是機(jī)體在環(huán)境脅迫下敏感的特征性指標(biāo)[40]。楊洪波等[41]研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類(lèi)受到藥物刺激時(shí)，耗氧率增加，與對(duì)照組相比紅細(xì)胞數(shù)量有所升高，崔素麗[42]在研究中也指出當(dāng)機(jī)體受到外界因子刺激而發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，白細(xì)胞數(shù)量會(huì)增加。本試驗(yàn)研究表明，2.3和4.6 mg·L-1染毒組在7、14和28 d時(shí)血細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組。9.2 mg·L-1濃度組在7 d時(shí)血細(xì)胞總數(shù)顯著高于對(duì)照，隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，血細(xì)胞數(shù)量呈明顯下降趨勢(shì)，并顯著低于對(duì)照組。根據(jù)Toxtree數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)化學(xué)物質(zhì)的分類(lèi)可知，對(duì)二甲苯屬于非極性麻醉化學(xué)物質(zhì)，其致毒機(jī)理主要由于其能夠非選擇性通過(guò)細(xì)胞膜，對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成損傷發(fā)揮其毒性作用[43]。幾項(xiàng)研究也表明，長(zhǎng)期暴露在對(duì)二甲苯條件下會(huì)增加肺組織細(xì)胞凋亡，淋巴細(xì)胞以及腎小管近端細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡數(shù)量[44-46]；白雪等[2]的研究表明，隨著染毒劑量的升高對(duì)二甲苯染毒組的細(xì)胞凋亡率顯著升高。因此作者認(rèn)為，高濃度的對(duì)二甲苯可能引起了血細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致血細(xì)胞數(shù)量降低，進(jìn)而影響褐牙鲆幼魚(yú)的血液功能，降低其免疫力。溶菌酶在魚(yú)類(lèi)非特異性免疫中發(fā)揮著重要作用，是魚(yú)類(lèi)免疫防御水平的另一個(gè)重要指標(biāo)[47]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，對(duì)二甲苯染毒暴露對(duì)牙鲆血清中溶菌酶活力具有顯著抑制作用。一般認(rèn)為，魚(yú)類(lèi)在低濃度的外源污染物刺激時(shí)，能夠造成免疫系統(tǒng)產(chǎn)生代償性應(yīng)激來(lái)調(diào)節(jié)自身狀態(tài)，然而在高濃度長(zhǎng)時(shí)間暴露下則會(huì)超出其生理調(diào)節(jié)能力，產(chǎn)生免疫毒性[48]。本研究結(jié)果表明對(duì)二甲苯長(zhǎng)期(28 d)暴露下抑制了褐牙鲆幼魚(yú)的血細(xì)胞和溶菌活力，而其對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)免疫力的影響有待于通過(guò)病原攻毒實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

致謝：感謝中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物環(huán)境生理學(xué)研究室的同學(xué)們?cè)趯?shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖管理和取樣中給予的幫助。