對二甲苯對褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼魚的毒性效應研究

藺鵬飛，苗晶晶,，潘魯青，林雨霏，武江越

1. 中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，青島 266003 2. 國家海洋局海洋減災中心，北京 100194

對二甲苯是一種重要的工業(yè)原料，被廣泛用于農(nóng)藥、塑料和纖維合成等行業(yè)。2015年，全球?qū)Χ妆侥戤a(chǎn)量達3 696萬噸，其中中國的全年產(chǎn)量達到882萬噸，占全球?qū)Χ妆侥戤a(chǎn)量的23%。對哺乳動物的研究表明，對二甲苯具有神經(jīng)毒性、遺傳毒性、胚胎毒性以及致畸作用[1-3]，目前對二甲苯已被國際海事組織列入高泄漏風險危險化學品名單[4]。2007年，位于中國珠海港恒基達鑫化工碼頭的一艘外籍工船發(fā)生對二甲苯泄漏，造成約計400升的對二甲苯傾入海中[5]。目前對二甲苯對水生生物的毒性作用研究較少。范亞威和周啟星[6]研究了二甲苯對斑馬魚的急性致死效應，然而海洋魚類和淡水魚類對二甲苯的敏感性可能存在較大的區(qū)別，而對二甲苯對海洋魚類的毒性效應研究還未見報道。因此亟需了解對二甲苯等危險化學品對海洋生物特別是經(jīng)濟種類的毒性作用，為海洋危險化學品泄露的風險評估提供依據(jù)。

近年來我國海水養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，截至2012年為止我國海水養(yǎng)殖面積達2 180 927公頃，養(yǎng)殖產(chǎn)量達1 643.81萬噸，海水魚類產(chǎn)量超過100萬噸[7]。褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)是名貴的冷溫性海水魚類，由于其經(jīng)濟價值高，近10年來逐漸成為我國黃渤海海域的重要增養(yǎng)殖魚類品種，同時也是毒理學研究和檢測的常用受試生物[8]。二甲苯包括鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯3種同分異構(gòu)體，本研究選擇應用最為廣泛的對二甲苯開展研究，通過急性和亞慢性暴露試驗，研究了其對褐牙鲆幼魚的致死效應與生長抑制效應，通過測定對二甲苯脅迫下褐牙鲆幼魚肝臟的脂質(zhì)過氧化、DNA損傷效應、腦組織中乙酰膽堿酯酶活性(AchE)、血細胞總數(shù)變化以及血清中溶菌酶活力等評價指標，解析對二甲苯對褐牙鲆的遺傳毒性、神經(jīng)毒性以及免疫毒性效應，進而全面系統(tǒng)地了解對二甲苯對海洋魚類的毒性作用機制，為對二甲苯的海洋生態(tài)毒理評價提供科學依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗用魚

試驗所用的褐牙鲆幼魚取自煙臺海陽市黃海水產(chǎn)養(yǎng)殖廠。實驗魚類的規(guī)格分為2種，一種是孵化后60 d的幼魚，平均體長為4～6 cm，平均體重為(4.2±0.3) g，被用于急性毒性試驗。另一種規(guī)格為孵化后6個月的幼魚，平均體長為6～8 cm，平均體重為(6.7±0.6) g，被用于生長實驗和亞慢性毒性試驗。實驗魚的10 d暫養(yǎng)條件為：溶解氧7.0～7.5 mg·L-1，鹽度33～35，溫度(18±1) ℃，pH 8.1。暫養(yǎng)期間投喂通威牌魚用飼料，每天投喂的量為實驗用魚體重的3%。

1.2 急性毒性試驗

急性毒性試驗參考OECD (Organization for Economic Cooperation and Development)化學品測試導則進行[9]，共設(shè)置5個染毒濃度和1個空白對照，每組設(shè)置3個平行。染毒濃度分別為20、40、80、160和320 mg·L-1。本實驗采用半靜態(tài)試驗方法，每24小時更換95%的試驗液，試驗期間持續(xù)充氣并盡可能保持水槽處于密封狀態(tài)。對二甲苯暴露實驗條件與暫養(yǎng)期間保持一致。在暴露96 h期間，各處理組隨機6次取水樣測定水體中對二甲苯濃度，以6次平均值表示對二甲苯的實際濃度。水體中對二甲苯含量測定參考頂空-毛細管柱氣相色譜法(GB/T-5750.8—2006)[10]，采用Agilent 6890N型氣相色譜儀進行檢測，毛細管色譜柱為FFAP 25 m ×0.32 mm；載氣為高純氮；燃氣為純氫；進樣溫度為150 ℃；柱溫為50 ℃，檢測器溫度為160 ℃；線流速為30 cm·s-1；分流比為10:1；進樣量為800 μL。魚類死亡的判斷標準為用玻璃棒觸碰尾部沒有任何反應。試驗數(shù)據(jù)采用概率單位分析法求出96 h的半致死濃度(LC50)及其95%置信區(qū)間。

1.3 28 d慢性暴露實驗

1.3.1 28 d慢性暴露試驗設(shè)計

根據(jù)急性毒性的實驗結(jié)果選取96 h-LC50的1/20、1/40和1/80作為3個亞慢性毒性試驗暴露濃度，即2.3、4.6和9.2 mg·L-1，每組設(shè)置3個平行，試驗條件與急性毒性試驗一致。在試驗開始之前和暴露28 d之后每組取8尾受試魚測量體重，用于計算魚類的增重率和特定生長率的變化[11]。增重率和特定生長率的計算公式如下：增重率(%)=(W2-W1)×100/W1，特定增長率(%)=100×[(lnW2-lnW1)/T]。其中W2和W1分別表示結(jié)束和開始時的體重，T代表染毒暴露的時間。

28 d慢性暴露實驗期間分別于實驗開始后的0、7、14、21和28 d時取樣用于亞慢性毒性指標的測定。取樣時從各個水槽內(nèi)隨機選取8尾褐牙鲆幼魚，用2 mL針筒于尾靜脈處取血，并立即進行血細胞計數(shù)[12]。剩余血液樣品于4 ℃下，經(jīng)2 000 r·min-1離心分離，收集血清，于-80 ℃冷凍保存，用于溶菌酶活力測定。取血后迅速解剖魚體并取出肝臟和魚腦組織于液氮中冷凍，冷凍保存于-80 ℃用于脂質(zhì)過氧化、DNA損傷和乙酰膽堿酯酶(AchE)活性測定。

1.3.2 生理生化指標測定

脂質(zhì)過氧化的方法采用測定次級氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量的方法，根據(jù)Wills的方法[13]稍加改進：將組織用體積為1∶19的勻漿緩沖液(pH=7.7, Na2HPO4·12H2O 0.125 mol·L-1, K2HPO4·12H2O 0.125 mol·L-1, Na2EDTA 0.05 mol·L-1)于冰浴中勻漿，勻漿后4 ℃、1 200 g離心30 min，收集上清液用于實驗指標的測定。取200 μL上清液，加入100 μL 20% TCA(包含1 mmol·L-1FeSO4)和200 μL 0.67%硫代巴比妥酸試劑，在90 ℃水浴10 min，3 000 r·min-1離心5 min，取200 μL上清液在530 nm讀取吸光值OD530，單位為nmol·mg-1。蛋白質(zhì)含量測定以牛血清白蛋白為標準物，采用Bradford的方法[14]測定。

DNA堿解旋的測定方法參照Ching的方法[15]利用熒光分光光度計定量組織中雙鏈和單鏈DNA含量，DNA的完整性用F值表示，計算公式為F=(XauDNA-XssDNA)/(XdsDNA-XssDNA)，式中X為熒光值，dsDNA為雙鏈DNA，ssDNA為單鏈DNA，auDNA為堿解旋后的DNA。

AChE的活性測定采用Ellman的方法[16]，原理是碘化硫代乙酰膽堿被AChE分解為乙酸和硫代膽堿，硫代膽堿與DTNB生成一種黃色絡(luò)合物，在412 nm處顯色。取100 μL的磷酸鹽緩沖液中加入50 μL酶液，于35 ℃保溫20 min。然后依次加入50 μL碘化硫代乙酰膽堿(75 mmol·L-1)、100 μL DTNB溶液(20 mmol·L-1)，置于96孔酶標板上迅速混合，在波長為412 nm處讀取吸光值。蛋白質(zhì)含量測定以牛血清白蛋白為標準物，采用Bradford的方法[14]測定。酶活力定義為每毫克蛋白AChE的活性單位數(shù)表示。

溶菌酶活力的測定采用Hultmark方法[17]，以溶壁微球菌凍干粉為底物，用pH=6.4的磷酸鉀緩沖液配成底物懸液，取200 μL該懸液與20 μL待測液血清于96孔酶標板中混勻，于570 nm處測量吸光度A1，28 ℃下水浴30 min終止反應，測定吸光度A2。溶菌酶活力(U·mL-1)計量方式采用(A1-A2)/A2。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗結(jié)果均以3個平行組的平均值±標準差(Means ± S.D)表示。用數(shù)據(jù)軟件SPSS 17.0 進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan檢驗，P<0.05代表差異顯著。

2 實驗結(jié)果(Results)

2.1 致死和生長

試驗期間測定的各濃度組水體中對二甲苯的濃度分別為(18.25±0.5)、(34.52±0.5)、(72.63±0.8)、(147.24±0.6)和(303.77±0.5) mg·L-1。對二甲苯對褐牙鲆幼魚的96 h-LC50是45.7 (33.516～59.741) mg·L-1。回歸方程y=-4.328+2.607x。試驗過程中對照組沒有死亡現(xiàn)象，其中20 mg·L-1染毒組的死亡率為25%，320 mg·L-1染毒組褐牙鲆幼魚的死亡率為100%。

如圖表1為褐牙鲆幼魚經(jīng)過28 d暴露后，增重率和特定生長率的抑制情況。2.3、4.6和9.2 mg·L-1暴露組的增重率和特定生長率與對照組相比受到顯著抑制(P<0.05)。其中9.2 mg·L-1的暴露組中褐牙鲆幼魚的生長抑制達到最高，增重率和特定增長率分別為對照組的21.27%和23.07%。

表1 對二甲苯暴露28 d后對褐牙鲆幼魚的生長抑制效應Table 1 Effects of p-xylene on growth of P. olivaceusafter 28 days of feeding

注：數(shù)據(jù)用平均值±標準差(Means ± S.D)表示，同列中不同字母表示2組間差異顯著(P< 0.05)。Note: Data are presented as means ± S.D. Means in the same column with different letters differ significantly from each other (P< 0.05).

2.2 對二甲苯對褐牙鲆幼魚肝臟的脂質(zhì)過氧化與DNA損傷效應

經(jīng)過不同濃度和時間的對二甲苯暴露后，實驗魚肝組織的MDA含量變化如圖1所示：在7 d時，2.3 mg·L-1濃度組中MDA含量與對照組相比并無顯著性差異(P<0.05)。從14 d開始時，各個濃度組MDA含量與對照組相比均表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)，各濃度組的MDA含量整體呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。2.3 mg·L-1和4.2 mg·L-1染毒濃度的褐牙鲆幼魚肝臟中MDA含量均在14 d時達到最高值，其含量分別為對照組的175.11%和175.85%。在9.2 mg·L-1染毒組中觀察到，MDA含量在21 d時達到最高值，其含量約占對照組的197.71%。

圖1 對二甲苯對褐牙鲆幼魚肝臟脂質(zhì)過氧化影響Fig. 1 Effects of p-xylene on lipid peroxide (MDA) levels in fish liver

圖2 對二甲苯對褐牙鲆幼魚肝臟DNA損傷的影響Fig. 2 Effects of p-xylene on DNA damage (F value) levels in fish liver

對二甲苯對褐牙鲆幼魚DNA堿解旋的影響如圖2所示：對二甲苯對褐牙鲆幼魚肝臟DNA損傷存在時間-劑量效應關(guān)系，隨著暴露濃度和染毒時間的增加，DNA損傷增加。7 d時各濃度組與對照組相比并沒有顯著性變化(P<0.05)，28 d時，各濃度組與對照組相比顯著降低(P<0.05)，分別為對照組的75.92%、64.81%和61.11%。

2.3 對二甲苯對褐牙鲆幼魚腦組織AChE活力的影響

對二甲苯暴露質(zhì)量濃度與AChE活性之間具有明顯的劑量-效應關(guān)系(圖3)：隨著染毒時間和暴露濃度的增加，2.3、4.6和9.2 mg·L-1的暴露組的AChE活性與對照組相比顯著降低(P<0.05)，并在28 d時達到最小值，分別是對照組的78.11%、65.11%和57.40%。

圖3 對二甲苯對褐牙鲆幼魚腦乙酰膽堿酯酶活性的影響Fig. 3 Effects of p-xylene on brain acetylcholinesterase (AchE) of Paralichthys olivaceus

2.4 對二甲苯對褐牙鲆幼魚的總血細胞數(shù)量和溶菌酶活力的影響

對二甲苯對褐牙鲆幼魚的總血細胞數(shù)量影響顯著(P<0.05)，7 d時各濃度組總血細胞數(shù)量顯著高于對照組(P<0.05)，14 d時9.2 mg·L-1染毒組的血細胞數(shù)量顯著降低并達到最低值，血細胞數(shù)量是對照組的68.49%。14 d和21 d時2.3和4.6 mg·L-1濃度組的血細胞數(shù)量仍顯著高于對照組，而9.2 mg·L-1濃度組的血細胞數(shù)量低于對照水平(圖4)。對二甲苯能夠顯著降低褐牙鲆幼魚血清溶菌酶活力(P<0.05)，隨著染毒時間增加(14～28 d)，各染毒組(2.3，4.2和9.2 mg·L-1)溶菌酶活力顯著下降，而對照組在試驗期間并無顯著性變化。2.3、4.6和9.2 mg·L-1染毒組分別于21 d和28 d時達到最小值，分別為對照組的60.71%、73.91和81.19%(圖5)。

圖4 對二甲苯對褐牙鲆幼魚血細胞總數(shù)的影響Fig. 4 Effects of p-xylene on total hemocyte counts of P. olivaceus

圖5 對二甲苯對褐牙鲆幼魚血清中溶菌酶活力的影響Fig. 5 Effects of p-xylene on lysozyme activity of P. olivaceus

3 討論(Discussion)

3.1 對二甲苯對褐牙鲆幼魚存活和生長的影響

已有研究表明，二甲苯對花條鱸魚(Moronesaxatilis)、黑頭呆魚(Pimephalespromelas)、網(wǎng)紋鳉(Poeciliareticulata)、虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss)和鯽魚(Carassiusauratus)的LC50分別為2.0 μL·L-1(96 h)、8 870 μg·L-1(96 h)、8 800 μg·L-1(96 h)、2 600 μg·L-1(96 h)和18 000 μg·L-1(24 h)[18-21]。本實驗研究獲得對二甲苯對褐牙鲆幼魚的96 h-LC50值為45.7 mg·L-1。由此表明6種魚類對對二甲苯的敏感度依次為花條鱸魚>虹鱒魚>網(wǎng)紋鳉>黑頭呆魚>鯽魚>褐牙鲆。根據(jù)化學物質(zhì)對魚類毒性分級標準(國家環(huán)保局水和廢水監(jiān)測分析方法編委會，2002)，二甲苯對褐牙鲆幼魚的毒性屬于中等毒性，與范亞威和周啟星[6]對斑馬魚的研究結(jié)果一致。目前關(guān)于對二甲苯對魚類生長抑制的研究還未有報道，本研究表明，2.3、4.6和9.2 mg·L-1這3個染毒組均能顯著抑制牙鲆幼魚體重的增加，并降低其增重率和特定增長率，這表明暴露于對二甲苯(>2.3 mg·L-1)28 d對褐牙鲆幼魚具有顯著的生長抑制作用。

3.2 對二甲苯對褐牙鲆幼魚的肝臟毒性

二甲苯在哺乳動物肝臟內(nèi)代謝主要通過一個甲基的氧化進行，通過細胞色素CYP450 2E1將污染分子轉(zhuǎn)化成甲基芐醇，進一步通過生物轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸[22]。在這一代謝過程中，組織中的氧化自由基增加，可誘發(fā)生物體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化、DNA鏈斷裂等氧化損傷[23]，因此查明這些生物標志物的活性變化可反映氧化應激的存在，常被作為環(huán)境污染脅迫的生物標志物。

丙二醛(MDA)含量是脂質(zhì)過氧化反應的分解產(chǎn)物，MDA的產(chǎn)生主要是由于未經(jīng)抗氧化酶轉(zhuǎn)化的超氧陰離子及其他自由基對細胞膜多不飽和酸進行攻擊，產(chǎn)生了LOOH等過氧化物所致，其含量能夠反映脂質(zhì)過氧化的水平[24]。Jajte等[25]研究發(fā)現(xiàn)對二甲苯的脂質(zhì)過氧化作用是其誘導小鼠肝臟毒性的主要途徑。本實驗研究表明，2.3 mg·L-1濃度組肝臟中的MDA含量在7 d時與對照組并無顯著差異，14 d以后各濃度組的MDA含量均顯著增加；在9.2 mg·L-1處理組中觀察到，MDA含量在21 d時達到最高值。已有研究表明，對二甲苯能夠顯著影響大彈涂魚肝臟中的MDA含量，且肝臟中MDA的產(chǎn)生主要是由于谷胱甘肽的再生量不足以完全清除LOOH，使過氧化物再經(jīng)分子內(nèi)的環(huán)化、裂解等步驟產(chǎn)生[26]。在本研究中對二甲苯暴露7 d時未產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化損傷表明短期暴露機體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)能夠去除多余的活性氧(ROS)，因而氧自由基并未對肝臟細胞造成明顯損傷，然而高濃度組在21 d時MDA含量顯著增高表明高濃度長期的暴露會導致褐牙鲆幼魚肝臟中的脂質(zhì)過氧化增加，氧自由基對褐牙鲆幼魚的肝臟細胞造成明顯的毒性作用。

已有研究表明二甲苯暴露能夠?qū)Σ溉閯游锖腿祟愒斐蒁NA損傷。呂丹瑜等[27]的研究表明，二甲苯可引起妊娠母鼠外周血有核細胞DNA損傷。倪祖堯和逢兵[28]研究發(fā)現(xiàn)接觸苯、甲苯和二甲苯的工人外周血細胞會造成DNA損傷。但是目前對二甲苯對水生生物，尤其是魚類的遺傳毒性作用所知甚少。本實驗中褐牙鲆幼魚肝臟F值在7 d時各濃度組與對照組相比無顯著性差異，Rogers等[29]對小鼠的研究同樣也表明了短期對二甲苯的暴露不能對小鼠造成DNA損傷，這與本實驗的研究結(jié)果一致。因此作者認為對二甲苯暴露并不能在短時間內(nèi)對褐牙鲆幼魚肝臟造成DNA損傷。另外本實驗研究顯示在14、21和28 d時，各濃度組均與對照組顯著性差異(P<0.05)，且均有良好的時間-劑量效應關(guān)系。由此說明對二甲苯長期(28 d)暴露能夠引起幼魚肝臟的DNA損傷。對于苯類物質(zhì)產(chǎn)生DNA損傷的機制，Andreoli等[30]的研究表明，苯在肝臟中經(jīng)細胞色素P4502E1酶的催化作用，代謝成酚的代謝物，這些產(chǎn)物經(jīng)氧化還原產(chǎn)生羥自由基等活性氧物質(zhì)，從而導致DNA鏈斷裂；Niaz等[31]的研究表明對二甲苯屬于高脂溶性有機溶劑，能夠使細胞膜破裂，產(chǎn)生DNA裂解酶，最終造成DNA鏈斷裂。由本實驗得到的對二甲苯導致的脂質(zhì)過氧化損傷結(jié)果，作者推測對二甲苯所致的氧化損傷可能是造成褐牙鲆幼魚DNA損傷的主要途徑。

3.3 對二甲苯對褐牙鲆幼魚的腦神經(jīng)毒性

AChE是與神經(jīng)活動密切相關(guān)的重要物質(zhì)，是表征污染物神經(jīng)毒性的重要生物標志物[32]。Sandahl等[33]的研究發(fā)現(xiàn)，AChE活性抑制和魚類的游泳以及攝食能力具有明顯的正負相關(guān)性。Le Bris等[34]和Sturm等[35]也證明抑制AChE活性，能夠降低魚類的攝食活動，進而影響魚類的生長。本文結(jié)果表明，對二甲苯(2.3～9.2 mg·L-1)作用下能夠顯著誘導褐牙鲆幼魚腦組織內(nèi)AChE活性，且AChE酶活力下降與染毒濃度以及暴露時間與具有明顯的正負相關(guān)性。因此作者認為對二甲苯的神經(jīng)毒性可能是造成的褐牙鲆幼魚的生長抑制效應的重要原因。對二甲苯具有揮發(fā)性和脂溶性高等特征，其穿過血腦屏障后能改變相鄰細胞之間的滲透性和神經(jīng)信號的傳導功能，甚至促使細胞膜和膜質(zhì)中的脂類物質(zhì)溶解，從而誘發(fā)神經(jīng)毒性[36]。顏士勇等[37]的研究證實，二甲苯對大鼠神經(jīng)細胞具有直接的毒性作用。本研究中長期暴露下對二甲苯對褐牙鲆幼魚肝臟造成了顯著的脂質(zhì)過氧化損傷，這表明對二甲苯對褐牙鲆幼魚的長期毒性效應會導致大量活性氧自由基無法清除。由于腦組織內(nèi)抗氧化防御酶系表達量較低，極易受到自由基的攻擊[38]，因此對二甲苯的脂質(zhì)過氧化損傷也可能造成褐牙鲆幼魚的神經(jīng)毒性，而其對褐牙鲆腦組織的氧化損傷效應有待于進一步的研究。

3.4 對二甲苯對褐牙鲆幼魚的免疫毒性

血液指標被廣泛地用于評價魚類的健康狀況以及對環(huán)境的適應能力，同時也作為毒理學指標用來反映污染物對魚類免疫水平的影響[39]。魚類血細胞數(shù)量變化是機體在環(huán)境脅迫下敏感的特征性指標[40]。楊洪波等[41]研究發(fā)現(xiàn)，魚類受到藥物刺激時，耗氧率增加，與對照組相比紅細胞數(shù)量有所升高，崔素麗[42]在研究中也指出當機體受到外界因子刺激而發(fā)生應激反應時，白細胞數(shù)量會增加。本試驗研究表明，2.3和4.6 mg·L-1染毒組在7、14和28 d時血細胞數(shù)量顯著高于對照組。9.2 mg·L-1濃度組在7 d時血細胞總數(shù)顯著高于對照，隨著染毒時間的延長，血細胞數(shù)量呈明顯下降趨勢，并顯著低于對照組。根據(jù)Toxtree數(shù)據(jù)庫對化學物質(zhì)的分類可知，對二甲苯屬于非極性麻醉化學物質(zhì)，其致毒機理主要由于其能夠非選擇性通過細胞膜，對細胞結(jié)構(gòu)造成損傷發(fā)揮其毒性作用[43]。幾項研究也表明，長期暴露在對二甲苯條件下會增加肺組織細胞凋亡，淋巴細胞以及腎小管近端細胞的細胞調(diào)亡數(shù)量[44-46]；白雪等[2]的研究表明，隨著染毒劑量的升高對二甲苯染毒組的細胞凋亡率顯著升高。因此作者認為，高濃度的對二甲苯可能引起了血細胞凋亡而導致血細胞數(shù)量降低，進而影響褐牙鲆幼魚的血液功能，降低其免疫力。溶菌酶在魚類非特異性免疫中發(fā)揮著重要作用，是魚類免疫防御水平的另一個重要指標[47]。本實驗研究表明，對二甲苯染毒暴露對牙鲆血清中溶菌酶活力具有顯著抑制作用。一般認為，魚類在低濃度的外源污染物刺激時，能夠造成免疫系統(tǒng)產(chǎn)生代償性應激來調(diào)節(jié)自身狀態(tài)，然而在高濃度長時間暴露下則會超出其生理調(diào)節(jié)能力，產(chǎn)生免疫毒性[48]。本研究結(jié)果表明對二甲苯長期(28 d)暴露下抑制了褐牙鲆幼魚的血細胞和溶菌活力，而其對褐牙鲆幼魚免疫力的影響有待于通過病原攻毒實驗進一步證實。

致謝：感謝中國海洋大學水產(chǎn)動物環(huán)境生理學研究室的同學們在實驗動物養(yǎng)殖管理和取樣中給予的幫助。