ZnO納米粒子通過線粒體通路抑制小鼠光感受器細胞Na+/K+-ATP酶表達和活性的作用研究

劉濱，殷學偉，郭勵劼，丁紅燕，畢宏生，郭大東,*

1. 山東中醫藥大學第二臨床醫學院，濟南 250014 2. 青島農業大學生命科學學院，青島266109 3. 淮陰工學院，江蘇省介入醫療器械研究重點實驗室，淮安 223003 4. 山東中醫藥大學眼科研究所，濟南 250002

目前，隨著納米技術的發展，越來越多的納米材料已在基因轉染[1-2]、疾病診斷[3-4]、藥物傳輸[5-6]等生物醫學領域被廣泛應用。由于缺乏系統評估，納米材料對生物體的風險及對人類身體健康的潛在影響仍然是一個值得關注的問題。

最近，研究人員發現ZnO納米材料能對生物發揮潛在的遺傳毒性[7-9]。ZnO納米粒子釋放到水生生態系統中，能夠通過當地和工業廢水對魚類和其他生物產生有害的影響[10]，其遺傳毒性與ROS水平升高[11]、鈣穩態的失衡[12]、相關信號轉導通路如絲裂原活化蛋白激酶信號通路[13]、caspase依賴的信號通路[14]等的激活有關。然而，ZnO納米粒子引起細胞毒性的作用機制仍不十分清楚。

線粒體是細胞內一種重要的細胞器，在電子傳遞、線粒體跨膜電位、氧化磷酸化以及ROS的產生和清除[15]等活動中起重要的作用。過量的ROS會促進細胞色素C的釋放、引起caspase激活，進而引起細胞損傷或細胞死亡[16]。ATP依賴的Na+/K+-ATP酶可通過ATP水解提供能量，保持細胞內外Na+和K+梯度，對維持細胞膜電位和正常細胞的生理功能具有重要作用[17-18]。其中，由atp1a1基因編碼的Na+/K+-ATP酶亞型被認為在所有細胞中均表達[19-21]，由atp1b2基因編碼的Na+/K+-ATP酶亞型主要表達于不同的神經細胞以及視網膜光感受器細胞[22-23]。通過Na+/K+-ATP酶調節Na+和K+梯度對維持膜電位和細胞電興奮性至關重要[18, 24]，Na+/K+- ATPase的功能障礙會導致細胞離子梯度的喪失，導致細胞損傷甚至死亡。

研究證實，視網膜在感光終端區具有較高水平的鋅離子，并對調節谷氨酸釋放、維持光感受器細胞功能發揮作用[25]。細胞毒作用研究表明，ZnO納米粒子能破壞正常的細胞[26]，如人晶狀體上皮細胞[27]、肺上皮細胞[28]、視網膜神經節細胞[14]和小鼠感光細胞的生理功能，其機制與鈣離子(Ca2+)、自噬、凋亡、轉化生長因子(TGF-β)和基質金屬蛋白酶(MMP)等信號轉導通路有關。我們前期研究發現，通過降低TGF-β和MMP-9的表達，ZnO納米粒子可以抑制小鼠視網膜感光細胞的增殖和遷移[26]，并可抑制超氧化物歧化酶(MnSOD)的表達和活性[29]。在本研究中，我們進一步觀察了ZnO納米粒子對661W細胞的細胞毒作用，探討其對小鼠光感受器細胞的LDH、Δφm、ROS水平、鉀離子通道以及Na+/K+-ATP酶的表達及其活性影響，有助于理解ZnO納米粒子引起細胞毒作用的相關作用機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 ZnO納米粒子及其溶液的制備

ZnO納米粒子購自上海譜振生物科技有限公司，純度大于99.7%；661W細胞由美國俄克拉荷馬大學健康衛生中心Muayyad教授惠贈。ZnO納米粒子經場發射掃描電子顯微鏡進行表征，其粒徑分布范圍為15到50 nm，平均粒徑為30 nm[30]。

1.2 細胞培養

661W細胞培養在DMEM培養基(DMEM，Life Technology，美國)中，并添加1 g·L-1的葡萄糖，10%胎牛血清(Hyclone公司，美國)，100 μg·mL-1鏈霉素和100 U·mL-1青霉素，并培養在37 ℃、5% CO2培養箱中；實驗過程中由自動細胞計數儀進行細胞計數(TC10，Bio-Rad公司，美國)。

1.3 LDH釋放檢測

使用LDH細胞毒性檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所，上海)檢測了ZnO納米粒子與661W細胞共培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中LDH的釋放水平。661W細胞(5×105細胞/孔)接種于6孔板中在37 ℃包含孵化器5%的CO2培養箱培養過夜，然后細胞與不同濃度的ZnO納米粒子(分別為0、31.25、62.5和125 μmol·L-1)共培養24 h，然后取不同處理條件下的細胞上清培養基120 μL用于LDH細胞毒性檢測。檢測試劑盒在室溫下反應30 min。以不含ZnO納米粒子培養的661W細胞上清液作為陰性對照。所有的實驗操作程序都按照試劑供應商的操作說明進行。

1.4 細胞內ROS水平的測定

通過流式細胞儀(Accuri C6，美國)并使用2，7′- dichlorofluorescin二乙酸(DCFH-DA，Invitrogen公司，美國)測定細胞內ROS的水平變化。小鼠光感受器細胞(5×105細胞/孔)接種于6孔板中，培養過夜，然后用0、31.25、62.5和125 μmol·L-1的ZnO納米粒子分別共培養6 h。收獲細胞并用冷PBS溶液洗滌2次后，細胞用DCFH-DA溶液(10 μmol·L-1)懸浮，然后在黑暗條件下繼續培養30 min，再用PBS漂洗，漂洗結束后30 min內用流式細胞儀分析。在每個樣品的檢測中，收集2×104細胞進行檢測計數分析。

1.5 線粒體膜電位分析

Δφm是維持細胞正常的生理條件所必需的。通常用5,5'，6,6'- tetrachloro-1,1′,3,3′-四乙基苯并咪唑基碳菁碘(JC-1)在細胞線粒體中積累總量(其熒光紅色)以及在細胞質中的單體(其熒光綠色)變化進行檢測。細胞凋亡早期的Δφm下降或消失，JC-1不能積聚在線粒體并消散為JC-1單體導致紅色熒光的消失[18]。因此，紅色熒光響應線性增加膜電位[31]。在本研究中，利用JC-1探針檢測細胞內Δφm的水平變化(碧云天生物技術研究所，南通)。661W細胞(5×104細胞/孔)接種于6孔板中，培養過夜后，分別用0、31.25、62.5和125 μmol·L-1的ZnO納米粒子孵育6 h。然后0.25%胰蛋白酶消化后，收集細胞，PBS洗2次，再用JC-1探針溶液孵育(37 ℃)30 min，在黑暗條件下，用冷PBS洗滌2次，最后，通過流式細胞儀測定Δφm(BDVerse，BD Biosciences公司，美國)。

1.6 全細胞膜膜片鉗測定

電壓依賴性鉀離子(K+)通道(Kv)可以使鉀離子穿過細胞膜引起膜電壓的變化，并通過調節動作電位的形狀和頻率調節靶細胞的興奮性，從而具有生理和病理生理的影響[32]。本研究中，我們利用port-a-patch Nanion芯片系統(epc-10，Heka，Nanion，德國)在室溫(25 ℃)條件下進行全自動膜片鉗實驗。膜片鉗實驗前將661W細胞培養在6孔板。實驗時用PBS沖洗細胞，分離暴露在0.25%含1 mmol·L-1EDTA的胰蛋白酶中。用不同濃度(即0、31.25、62.5和125 μmol·L-1)ZnO納米粒子培養5 min后，用細胞膜片鉗測定延遲整流鉀電流的變化情況。用電解質溶液有以下成分：細胞外液含10 mmol·L-1NaCl, 75 mmol·L-1CsCl, 2 mmol·L-1MgCl2, 70 mmol·L-1CsF, 10 mmol·L-1Hepes/KOH, pH 7.2；細胞內液含10 mmol·L-1KCl, 75 mmol·L-1NaCl, 70 mmol·L-1NaF, 2 mmol·L-1MgCl2, 2 mmol·L-1CaCl2, 5 mmol·L-1D-glucose monohydrate, 2 mmol·L-1EGTA, 10 mmol·L-1Hepes/NaOH, pH 7.4。去極化電位為+40 mV的-80 mV的鉗制電位測定的延遲整流鉀電流。patchmaster軟件(Nanion，德國)用來記錄延遲整流鉀電流。

1.7 Na+/K+-ATP酶mRNA表達水平分析

661W細胞(2×105細胞/孔)接種于6孔板，培養過夜后采用不同濃度(分別為0、31.25、62.50和125 μmol·L-1)ZnO納米粒子孵育661W細胞2 h，經胰蛋白酶消化收集細胞并提取細胞總RNA，然后根據試劑盒的操作步驟，用Trizol試劑提取細胞661W的總RNA(艾德萊生物科技有限公司，北京)。首先用600 ng總RNA合成單鏈cDNA，然后以逆轉錄得到的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR分析。引物序列見表1，Q-PCR程序設置如下：95 ℃ 5 min，其次是95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個循環。實驗結果用各自的內源GAPDH控制后使用2ΔΔCT方法進行歸一法處理[33]。

表1 PCR擴增目標基因的引物Table 1 Primers in amplification of target genes by quantitative PCR

圖1 ZnO納米粒子對細胞形態和661W細胞釋放LDH的影響注：*P<0.05, **P<0.01，與對照比較。Fig. 1 Effects of ZnO nanoparticles on cell morphology and LDH release in 661W cellsNote: Scale bar = 20 μm；*P<0.05, **P<0.01, compared with control.

圖2 流式細胞儀檢測細胞和不同濃度的ZnO 納米粒子共培養24 h后ROS水平注：*P<0.05, **P<0.01，與對照比較。Fig. 2 ROS levels of 661W cells after exposure to different concentrations of ZnO nanoparticles for 24 hNote: *P<0.05, **P<0.01, compared with control.

1.8 細胞內Na+/ K+-ATP酶表達和活性分析

661W細胞(4×105細胞/孔)接種于6孔培養板中于37 ℃、CO2培養箱里過夜，后棄去上清液，再使用不同濃度(分別為0、31.25、62.50和125 μmol·L-1)的ZnO納米粒子繼續培養6 h，然后用0.25%含1% EDTA的胰蛋白酶溶液消化收集細胞、離心，用冷PBS懸浮細胞團洗滌細胞2次。再用0.5 mL冷PBS懸浮細胞團，在冰上超聲處理10 min后5 000 g離心10 min，收集上清溶液，進行蛋白定量，然后用ELISA試劑盒檢測100 μL上清中小鼠Na+/ K+-ATP酶的蛋白水平含量。實驗方法按照試劑盒供應商的實驗方案進行(武漢基因美生物科技有限公司，武漢)。此外，Na+/K+-ATP酶活性(每個樣品為50 μL)使用Na+/K+-ATP酶活性檢測試劑盒進行測定(南京建成生物工程研究所)。使用紫外可見雙光束分光光度計(4802S UV/VIS，尤尼科(上海)有限公司)在636 nm處測定吸光度值，每個實驗重復3次。

1.9 統計學分析

數據用至少3個獨立實驗的平均值±SD(標準偏差)表示。統計學分析采用One-way ANOVA的Newman-Keuls檢驗，P<0.05有統計學意義。

2 結果(Results)

2.1 LDH釋放度的測定

圖1顯示小鼠光感受器細胞在與不同濃度的ZnO納米粒子培養24 h后實驗組與陰性對照樣品(即細胞培養于不含ZnO納米粒子的溶液中)細胞形態和LDH釋放曲線。圖中看出，661W細胞暴露于ZnO納米粒子溶液24 h導致LDH釋放到培養基中的水平明顯升高，并且LDH在培養基中的釋放水平增加與細胞中ZnO納米粒子的培養濃度密切相關。

2.2 細胞內ROS水平的測定

661W細胞分別于0、31.25、62.5和125 μmol·L-1的ZnO納米粒子共培養6 h后，ROS的產生從1.8%±0.35%分別上升到31.7%±2.74%, 43.8%±2.97%和61.5%±5.36%(圖2)。隨著細胞培養基中ZnO納米粒子濃度的增加，ZnO納米粒子誘導的ROS水平也隨之升高，表明ROS的產生依賴于細胞中ZnO納米粒子的培養濃度。此外，ZnO納米粒子誘導產生的ROS與對照樣品產生的ROS相比，有顯著的統計學差異(P<0.05)。

2.3 線粒體膜電位的改變

ZnO納米粒子溶液與661W細胞共培養6 h后，紅色熒光強度明顯下降。如圖3所示，經31.25、62.50和125 μmol·L-1的ZnO納米粒子溶液處理細胞6 h后，小鼠光感受器細胞的Δφm從94.6%±1.2%分別下降到83.5%±1.6%, 75.1%±2.3% 和 64.3%±1.7%，證實ZnO納米粒子溶液處理可對661W細胞的Δφm產生明顯下調作用。

2.4 延遲整流外向鉀電流的抑制作用

如圖4所示，小鼠光感受器細胞具有較大的延遲整流外向鉀電流。然而，在細胞經不同濃度的ZnO納米粒子處理后，細胞的延遲整流鉀電流均表現出下降趨勢，并且呈濃度依賴性，即越高的ZnO納米粒子與靶細胞共培養，則會導致延遲整流鉀電流越小。

2.5 Na+ / K+-ATP酶表達水平的下降

用不同濃度的ZnO納米粒子培養661W細胞后，我們分別用實時熒光定量PCR以及ELISA對細胞內Na+/K+-ATP酶的mRNA和蛋白水平進行了檢測。圖5A顯示在經31.25、62.50和125 μmol·L-1的ZnO納米粒子溶液培養細胞后，細胞內Na+/K+-ATP酶Atp1a1 的mRNA水平下降到正常對照組細胞水平的45.7%、 62.5% 和 33.6%，同時Atp1b2的mRNA水平下降到正常對照水平的19.2%、31.9% 和26.8%，對照組與處理組的mRNA表達水平有明顯的統計學差異。

利用ELISA方法，我們還檢測了661W細胞內Na+/K+-ATP酶與不同濃度的ZnO納米粒子共培養6 h后蛋白質水平的變化。圖5B顯示了細胞暴露于不同濃度的ZnO納米粒子后Na+/K+-ATP酶的表達水平變化情況。我們觀察到小鼠光感受器細胞內Na+/K+-ATP酶的蛋白水平從15.03 pg·mg-1分別降低到11.88、10.77和9.81 pg·mg-1，并具有濃度依賴性。

圖3 不同濃度的ZnO納米粒子處理6 h后661W細胞Δφm變化注：*P<0.05, **P<0.01，與對照比較。Fig. 3 Alterations of Δψm in murine photoreceptor cells after treatment with different concentrations of ZnO nanoparticles for 6 hNote: *P<0.05, **P<0.01, compared with control.

2.6 Na+ / K+-ATP酶活性降低

細胞經31.25、62.50和125 μmol·L-1的ZnO納米粒子溶液處理后，Na+/K+-ATP酶的活性與未經處理的661W細胞Na+/K+-ATP酶的活性相比均有明顯的下降。如圖6所示，ZnO納米粒子處理可顯著降低Na+/K+-ATP酶的活性。我們發現Na+/K+-ATP酶活性從0.428下降到0.302、0.344和0.324 U ·mg-1，證實ZnO納米粒子溶液的處理可顯著抑制Na+/K+-ATP酶的活性。

3 討論(Discussion)

研究表明，ZnO納米粒子具有明顯的細胞毒作用，其作用機制與氧化應激有關[11]。Fu等[32]發現，工程納米材料因其尺寸小、高比表面積和高表面反應性可產生更高水平的ROS并誘導氧化損傷。暴露于ZnO納米粒子的661W細胞可能會導致細胞產生過量的ROS(圖2)。Yoo等[34]研究發現，Hela細胞可通過吸附和細胞內吞作用將帶正電荷的ZnO納米粒子吸入到細胞內部，進一步誘導細胞死亡并產生過多的ROS，這表明ZnO納米粒子對ROS的產生具有強烈的誘導作用。因此，ROS的過度產生會引發內質網應激作用而造成細胞損傷，最終誘導靶細胞凋亡或壞死。

已證實線粒體功能異常是造成Δφm下降的主要原因，可能會導致線粒體去極化、致凋亡蛋白釋放到細胞質中進而參與細胞凋亡[35]。同時，線粒體也是細胞內ROS的主要來源。因此，Δφm和ROS水平的測定對于線粒體功能正常與否提供了參考[36]。在本研究中我們發現，ZnO納米粒子可導致661W細胞Δφm下降，ZnO納米粒子溶液濃度越高，線粒體膜電位下降越大(圖3)。這一結果表明，線粒體膜電位的下降是細胞經ZnO納米粒子處理后誘導661W細胞死亡的關鍵所在。

圖5 不同濃度ZnO納米粒子處理后Na+/K+ -ATP酶的mRNA和蛋白水平表達注：*P<0.05, **P<0.01，與對照比較。Fig. 5 Expressions of Na+/K+-ATPase at mRNA and protein levels after treatment with different concentrations of ZnO nanoparticlesNote: *P<0.05, **P<0.01, conpared with control.

圖6 不同濃度的ZnO納米粒子處理后661W細胞Na+/K+ -ATP酶活性的測定注：*P<0.05, **P<0.01，與對照比較。Fig. 6 Measurement of Na+/K+-ATPase activity of murine photoreceptor cells after treatment with different concentrations of ZnO nanoparticlesNote: *P<0.05, **P<0.01, compared with control.

電壓依賴性鉀通道可以使膜電位依賴性K+的選擇性滲透，在維持正常的細胞的生理狀態發揮關鍵作用[37]。Zhao等[38]研究發現，采用全細胞膜片鉗技術，ZnO納米粒子能使大鼠海馬CA3區錐體神經元整流鉀電流從20 mV增加到90 mV。電生理實驗結果表明，ZnO納米粒子能阻斷電壓依賴性鉀通道的離子滲透途徑，影響細胞內外鈉離子和鉀離子的交換，從而使細胞的Δφm下降并破壞細胞內的微環境平衡，最終導致細胞損傷。

Na+/K+-ATP酶對于維持跨膜離子梯度和基本的細胞功能及存活至關重要。本文研究發現，細胞暴露于ZnO納米粒子可引起LDH水平升高和ROS水平增加，導致細胞內氧化應激的發生。如果細胞內過度氧化應激不能及時排除，這將抑制Na+/K+-ATP酶的表達和活性，擾亂細胞內外離子之間的Na+和K+的交換以及阻斷延遲整流鉀電流和膜電位的平衡，引起細胞損傷。Sawosz等[39]發現在雞胚胎發育的初期注射納米銀為可以增加Na+/K+-ATP酶的表達，影響細胞分化；同時，Bessemer等[40]還透露，淡水魚暴露在ZnO納米粒子可以增加鰓的Na+/K+ATPase活性，這結果可能是歸因于上皮通透性增加或結構重塑。基于上述研究結果，我們推斷，暴露于納米粒子后的Na+/K+-ATP酶活性的差異可以解釋為暴露于ZnO納米粒子的組織和納米材料的變化。

總之，ZnO納米粒子能明顯促進細胞內LDH釋放到培養基中，提高細胞內ROS的水平，破壞661W細胞的Δφm。小鼠感光感受器細胞暴露于ZnO納米粒子會降低延遲整流鉀電流和抑制Na+/K+-ATP酶的表達及其活性，從而破壞細胞內微環境的平衡，誘發細胞死亡，最終表現出ZnO納米粒子對661W細胞的毒性作用。我們的研究結果有助于闡釋ZnO納米粒子介導的鉀離子通道阻滯和Na+/K+-ATP酶抑制引起的小鼠光感受器細胞生長抑制和細胞毒作用。

致謝：本研究得到了江蘇省介入醫療器械重點實驗室開放基金項目(jr1602)和山東省醫藥衛生科技發展計劃(2013WS0251)的資助，在此表示感謝。