農藥類化合物對大型溞的毒性作用模式：與基線毒性化合物比較研究

閆俐辰，王曉紅，趙元慧

東北師范大學環境學院，長春130117

隨著工業的迅猛發展，越來越多的有機化合物被合成并釋放到環境中。這些化學品進入環境后，對環境造成一定程度的污染，并且對人類和環境中的生物造成極大的毒害作用。因此，世界各國對有機污染物的生態風險評價都極為關注[1]。近年來，農業生產越來越受到重視，而農藥在農業生產中擔任著無比重要的角色，根據農藥的作用不同可將農藥分為除草劑、殺蟲劑、殺菌劑等。盡管在農業生產中施用農藥可以提高農作物的產量，但是不合理的農藥施用會造成農藥在環境中的殘留。農藥經漂移和徑流等途徑進入到環境水體中，會對水生生物產生一定的毒害作用。研究表明二嗪農和敵草隆對斑馬魚早期生命階段均具有中等毒性，96 h-LC50值分別為6.5 mg L-1和4 mg L-1[2]。殺蟲劑馬拉硫磷對藍綠藻的生長具有一定的抑制效應，在濃度為200 mg L-1時能夠長期抑制其生長[3]。呋喃丹和敵敵畏均能夠抑制月牙藻細胞生長并改變其細胞形態[4]。許多農藥對許多水生生物均具有較大的毒性效應。

在水生生態風險評價中，研究有機污染物對水生生物的毒性作用模式至關重要[5]。Verhaar等[6]將有機污染物對水生生物的毒性作用模式分為麻醉型和反應型2種類型。其中，麻醉型化合物包括基線化合物和弱惰性化合物；反應型化合物包括非特殊反應型化合物和特殊反應型化合物。麻醉型化合物在整個毒性作用過程中不與有機體的各個靶位發生生物化學反應。這類化合物通過與細胞膜的非特異性作用，改變細胞膜的結構和功能，其毒性取決于其透過生物膜的能力，因此麻醉型化合物的毒性與辛醇/水分配系數logKow具有很好的相關性[7-10]。弱惰性化合物普遍包含氫鍵供體，能夠與生物分子發生氫鍵作用，因此它們的毒性略高于基線化合物的毒性[11]。非特殊反應型化合物具有特殊的結構和性質，能夠與普遍存在于生物大分子的某些結構發生反應，這類化合物的毒性效應較大。特殊反應型化合物能與某些受體分子特異性結合，毒性通常較大，并且作用機制非常復雜。反應型化合物的毒性通常明顯高于麻醉型化合物的毒性。研究表明，麻醉型化合物在魚體內的臨界濃度在一個較窄的范圍內變化，接近于常數，并且與毒性暴露方式無關；而反應型化合物能夠與生物大分子發生化學反應，從而導致其體內臨界濃度較低。盡管目前已有大量水生環境暴露的生物毒性數據，但是有機化合物在水中的濃度通常具有可變性，而在有機體靶位上的濃度是非常穩定的，可以反映有機化合物在生物體內的固有濃度[12]。因此，分析化合物在水生生物體內的臨界濃度將有助于判斷化合物對水生生物的毒性作用機理。

大型溞是水環境中無脊椎浮游動物的代表性生物，其以藻類為食，同時又是脊椎動物的餌料。因此，大型溞在水生生態系統的物質循環和能量流動中占據著重要的地位[13]。大型溞對多數毒性物質很敏感，且繁殖周期短，分布廣泛，易于培養，因此普遍被應用于化合物的毒性測試[14]。本文通過實驗測定了25種基線化合物對大型溞的急性毒性數據，并收集了57種農藥類化合物對大型溞的急性毒性數據，其中包括除草劑、殺蟲劑和殺菌劑。一方面，計算這25種基線化合物和57種農藥類化合物在大型溞體內的臨界濃度，將除草劑、殺菌劑和殺蟲劑在大型溞體內的臨界濃度與基線化合物進行比較；另一方面，應用各類農藥化合物對大型溞的急性毒性數據和化合物分子描述符建立QSAR模型，并研究典型農藥類化合物對大型溞的毒性作用機理。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 基線化合物和農藥類化合物對大型溞的急性毒性數據

本文通過實驗獲取了25種基線化合物對大型溞的急性毒性數據log1/EC50。受試生物大型溞(Daphniamagna)購自中國科學院水生生物研究所。大型溞置于(22 ± 2) ℃，并保持每天14 h:10 h亮暗比培養。我們選取出生6～24 h后的大型溞進行毒性測試。實驗中每種基線化合物設置5個濃度梯度，每個濃度設置3個平行實驗。化合物暴露48 h后檢查大型溞是否停止活動，并根據化合物劑量效應關系計算出化合物對大型溞的急性毒性值。25種基線化合物對大型溞的毒性數據log1/EC50、化合物CAS號、名稱、辛醇水分配系數、生物富集因子logBCF以及體內臨界濃度log1/CBR列于表1。

另外，從文獻和數據庫中收集了共計57種農藥類化合物對大型溞(Daphniamagna)的毒性數據[15-19]，這些數據均通過相同的實驗方法獲取，具有良好的可靠性和有效性，且部分化合物來自不同實驗室的毒性數據具有較高的重現性。毒性數據表示為LC50(48 h半數致死濃度，單位為mol·L-1)或EC50(48 h半數活動抑制濃度，單位為mol·L-1)。研究表明，化合物導致大型溞死亡和停止活動的濃度十分接近[20]，因此本文將以大型溞死亡和停止運動為測試終點的毒性數據整理為同一數據集。57種農藥類化合物對大型溞的毒性數據log1/EC50(log1/LC50)、化合物CAS號、名稱、辛醇水分配系數、生物富集因子logBCF以及體內臨界濃度log1/CBR列于表1。

1.2 體內臨界濃度的計算

體內臨界濃度CBR是指在一定時間內能夠引起50%生物死亡時化合物在生物體內的濃度[21]。因此，如果在毒性實驗中有機化合物在水相和生物相中達到平衡狀態時，體內臨界濃度可以表示為公式(1)[22-24]。

CBR = LC50×BCF

(1)

式(1)中，BCF為生物富集因子，本文中生物富集因子通過文獻中報導的化合物在大型溞體內的生物富集因子logBCF值與辛醇-水分配系數logKow的線性關系進行計算[25]。LC50值應用實測值或文獻中獲得的毒性數據。

1.3 分子描述符和統計分析

本文計算了20種分子結構描述符，其中包括疏水性參數logKow，Abraham參數(A,B,E,S,V)，氫鍵供體、受體數量(NHD、NHA)以及量子化學參數最高占據分子軌道能量(EHOMO)、最低未占據分子軌道能量(ELUMO)等。我們應用EPI Suite軟件計算化合物的辛醇水分配系數logKow；應用Algorithm Builder軟件計算化合物的Abraham參數，氫鍵供體、受體數量等參數；應用MOPAC軟件計算化合物的量子化學參數。20種分子描述符的名稱及其含義列于表2。

使用Minitab軟件對各農藥的毒性數據和各分子描述符進行多元線性回歸分析，每個公式給出化合物數量N、標準偏差S、相關系數R2以及Fisher檢驗F值，以此評價公式的擬合程度和顯著性水平。

表1 基線化合物和農藥類化合物對大型溞的急性毒性、生物富集因子和體內臨界濃度值Table 1 Toxicities of baseline and agricultural compounds to Daphnia magna, and their logBCF, logCBR values

表2 分子結構描述符Table 2 Molecular descriptors

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 基線化合物對大型溞的毒性與辛醇/水分配系數的關系

本文通過實驗測定了25種基線化合物對大型溞的急性毒性。這些基線化合物包含烷烴類、酮類、醚類、苯及其鹵代衍生物。通過將基線化合物的毒性與化合物分子描述符進行逐步回歸分析，我們發現基線化合物的毒性與辛醇水分配系數logKow具有較好的線性關系，相關公式如(2)所示：

log1/EC50= 1.30 + 0.918 logKow

(2)

N= 25S= 0.33R2= 0.90F= 212

通過比較公式的斜率和截距可以發現，該公式與文獻中報道的基線化合物對大型溞的急性毒性與logKow之間的線性關系十分接近(log1/EC50= 1.09 + 0.934logKow)[20]。這說明本公式具有良好的可靠性，基線化合物對大型溞的急性毒性與logKow的關系見圖1。

2.2 農藥類化合物對大型溞的毒性與化合物分子描述符的關系

根據公式(2)可知基線化合物對大型溞的毒性與logKow呈正比關系。然而，我們通過研究農藥類化合物對大型溞的急性毒性與logKow的關系發現，農藥類化合物的毒性與logKow具有較差的相關性(圖1)。逐步回歸分析表明，由于農藥類化合物的結構復雜，應用本文所計算的分子描述符未能建立擬合程度較高的QSAR模型。這表明農藥類化合物對大型溞的毒性具有不同的毒性作用機理。我們將農藥按照功能分為除草劑、殺菌劑和殺蟲劑，應用多元線性回歸分析分別建立了各類農藥對大型溞的急性毒性與化合物分子描述符之間的關系(公式3～5)。這些分子描述符反映了化合物的多種性質，如疏水性、電離性、親電性以及能否形成氫鍵等性質。

除草劑：log1/EC50= 1.30 + 0.934 logKow+ 1.20F+(3)

N= 34S= 0.34R2= 0.92F= 173

殺菌劑：log1/EC50=1.37+0.814 logKow+0.000011Hf+0.0147 TPSA

(4)

N= 33S= 0.59R2= 0.82F= 43

殺蟲劑：log1/EC50= 1.63 + 0.596 logKow- 0.426S+ 0.348V+ 1.93B+ 0.00663 CV

(5)

N= 65S= 0.91R2= 0.80F= 48

2.3 基于體內臨界濃度比較基線和農藥類化合物對大型溞的毒性作用機理

基線化合物與logKow的關系(公式2)可以通過體內臨界濃度的概念來解釋。眾所周知，LC50是導致大型溞半數死亡時有機污染物在水相中的暴露濃度，其是體外濃度。目前普遍認為描述有機污染物對生物真實毒性效應的指標應該用體內臨界濃度(CBR)。在理論上，如果實驗中有機物在生物體內能達到吸附平衡，體內臨界濃度(CBR)與體外濃度(LC50)的關系可以通過生物富集因子(BCF)關聯起來[26]。

BCF = CBR/LC50

(6)

log1/LC50= log1/CBR + logBCF

(7)

研究表明，大型溞的logBCF與logKow間具有很好的線性關系[25]，即：

logBCF = 0.850 logKow- 1.100

(8)

將該公式帶入公式(7)中，即可得到有機化合物對大型溞的急性毒性與logKow之間的關系，如公式(9)所示：

log1/LC50= log 1/CBR + 0.850 logKow- 1.100

(9)

圖1 基線化合物和不同類型農藥對大型溞的急性毒性與辛醇水分配系數logKow的關系Fig. 1 Relationships between log Kow and toxicities to Daphnia magna for baselines and pesticides

很多研究表明，基線化合物對水生生物是通過麻醉作用發揮毒性效應，其在生物體內的臨界濃度CBR值在一個很窄的范圍內變化，即接近于一個常數[20, 27]。我們通過公式(8)計算了25種基線化合物的logBCF值，然后通過公式(6)或(7)計算了這些基線化合物的CBR值。結果表明，除了丙酮外(CBR = 11.91 mmol·kg-1)，其他基線化合物在大型溞體內的臨界濃度范圍為0.92～7.59 mmol·kg-1(圖2)。該范圍和文獻報導中的基線化合物在魚體內的臨界濃度范圍極為相近(2～8 mmol·kg-1)[28]，這說明基線化合物對大型溞的毒性機理和對魚的毒性機理相同，大型溞的體內臨界濃度CBR值同樣接近于一個常數，同時也說明了為什么基線化合物對大型溞的毒性與logKow呈現正比關系(公式9)。

表1展示了根據公式(7)和(8)計算的25種基線化合物和57種農藥類化合物對大型溞的生物富集因子logBCF值和體內臨界濃度log1/CBR值。計算結果表明，除草劑在大型溞體內的臨界濃度CBR值范圍為0.08～3.30 mmol·kg-1；殺菌劑在大型溞體內的臨界濃度CBR值范圍為0～0.16 mmol·kg-1；殺蟲劑在大型溞體內的臨界濃度CBR值范圍為0～1.10 mmol·kg-1。顯而易見，農藥類化合物在大型溞體內的殘余量范圍顯著低于基線化合物在大型溞體內的殘余量。因此，大部分農藥類化合物對大型溞的毒性遠遠高于基線化合物，并且與大型溞生物分子發生化學反應。其中，除草劑對大型溞的毒性略低于殺菌劑和殺蟲劑。圖2表明了基線化合物和各農藥類化合物在大型溞體內的臨界濃度log1/CBR與logKow的關系。通過圖2可以看出基線化合物在大型溞體內的臨界濃度log1/CBR值在一個很窄的范圍內變化，從而使得基線化合物對大型溞的毒性值與logKow具有很好的線性關系。然而，對于農藥類化合物，尤其是殺蟲劑和殺菌劑，它們在大型溞體內的臨界濃度log1/CBR值變化范圍很大，從而使得這些化合物的毒性值不僅與生物富集(logKow)有關，而且與它們在生物體作用靶位上的濃度有關。

圖2 基線化合物和本文所研究的農藥在大型溞體內的臨界濃度與辛醇水分配系數的關系Fig. 2 Relationships between logKow and log CBR of Daphnia magna for baseline compounds and the studied agricultural chemicals

2.4 農藥類化合物對大型溞的毒性作用機理

上述研究表明農藥類化合物的log1/CBR值不是一個常數，在公式(9)中需要引入反應性分子描述符，反映農藥類化合物與生物受體間的化學反應。除草劑多通過干擾植物光合作用、植物激素以及植物生物合成等機理發揮效應，因而對大型溞的急性毒性作用機理較為簡單。通過建立QSAR模型表明，除草劑對大型溞的毒性接近于基線毒性，但略高于基線毒性。公式(3)表明除草劑對大型溞的急性毒性主要取決于化合物從水相向生物相分配的能力。另外，除草劑對大型溞的急性毒性還與化合物的離子化程度有關，化合物的離子化程度越高，化合物對大型溞的急性毒性越高。離子化會引起化合物的生物富集能力降低，但是離子化合物所帶正電荷易與蛋白質和核酸等生物大分子發生反應[29]。殺菌劑多通過抑制菌體內核酸或蛋白質等生物大分子合成發揮作用，其對大型溞的急性毒性效應主要與化合物的標準生成熱和極性表面積有關。化合物的標準生成熱和極性表面積越大，化合物對大型溞的急性毒性越大。公式(4)表明殺菌劑的穩定性越低，其對大型溞的急性毒性越大[30]。另外，化合物的極性表面積多指氧原子或氮原子，這些原子具有較強的吸電子能力，且易于生物分子發生氫鍵作用。殺蟲劑多通過抑制生物神經系統、呼吸作用和生殖機能發揮效應[31]，大型溞是水環境中無脊椎動物的代表性生物，其生理系統與植物生理系統相差較大，而與昆蟲生理系統較為接近，這可能是殺蟲劑對其毒性較高的原因。公式(5)表明殺蟲劑對大型溞的急性毒性效應與化合物的分子極性、分子體積、氫鍵堿度和科斯模體積有關。化合物的分子極性越高，化合物對大型溞的急性毒性越低。盡管增加化合物的極性能夠增加化合物與靶位分子的結合能力[32]，但是化合物極性表面積過高能夠降低其向生物相分配的能力。另外，化合物的分子體積和科斯摩體積在一定程度上與其向生物相中分配的能力和與生物分子間的范德華力有關。殺蟲劑對大型溞的毒性還與其氫鍵堿度有關，分子堿性越強毒性越高。根據公式(5)計算結果表明，這些殺蟲劑對大型溞的毒性效應與其和生物分子之間的氫鍵和范德華力有關。另外，盡管殺蟲劑普遍對大型溞具有較高的毒性，但是仍然有一些疏水性較高的殺蟲劑對大型溞的毒性接近基線毒性。一方面是由于高疏水性化合物在水中溶解度較低，從而導致其生物利用率降低；另一方面是由于高疏水性化合物對水生生物的毒性往往以麻醉性毒性為主，反應性毒性為輔。

綜上所述：本文將農藥類化合物和基線化合物對大型溞的毒性作用機理進行比較研究，發現多數農藥類化合物對大型溞為反應性毒性作用模式，不同類別的農藥對大型溞的毒性作用機理不同。其中，除草劑的毒性顯著低于殺菌劑和殺蟲劑的毒性。我國是農業大國，農藥在農業生產中的使用必不可少，其在生產和使用過程中能夠對人類及環境中的生物產生毒害作用。因此，研究農藥類化合物對水生生物的毒性作用機理對于今后農藥的生產和使用具有一定的參考價值。未來我們會通過測定農藥在生物體內的濃度變化進行典型農藥類化合物在生物體內的毒代動力學研究。