紅霉素對連續3個世代多刺裸腹溞存活和生殖的影響

儲斌，席貽龍，朱凌云，馮若楠

安徽師范大學生命科學學院，安徽省重要生物資源的保護和利用研究省級重點實驗室，皖江城市帶退化生態系統的恢復與重建安徽省協同創新中心，蕪湖 241000

抗生素的發現被認為是20世紀最重要的科學成就之一。抗生素不僅被廣泛地用于人和動物疾病的預防和治療，還被作為生長促進劑添加于飼料中用于畜禽和水產養殖業[1]。常規服用的抗生素，約有50%～90%以原藥或其代謝物形式通過糞尿被排出體外，然后通過污水處理后間接進入環境，或通過施肥直接進入環境中[2]。紅霉素的長期使用使得地表水、地下水以及處理過的污水中均有殘留[3-7]，其生物活性即使是在非常低的濃度下(ng·L-1)也可能威脅水生態環境和人類健康[8-11]。因此，研究紅霉素對水生生物的影響具有重要的意義。

有關紅霉素對水生生物的毒性作用研究，已有一些報道：研究所使用的受試生物包括細菌、藻類、浮萍、原生動物、輪蟲、枝角類、庫蚊、魚類和兩棲動物等類群的多種生物；實驗終點涉及半數致死濃度等急性毒性實驗指標以及存活、生長、生殖和遺傳毒性等慢性毒性實驗指標[8,12-21]。然而，上述研究均只涉及單一世代的受試生物。自然水體中，水生生物是持續暴露于環境污染物之中的，僅研究預先沒有暴露于污染物中的母體可能會低估污染物的毒性作用[22-24]。因此，研究污染物對連續世代的水生生物的毒性作用具有重要的意義；但有關紅霉素對連續世代的枝角類存活和生殖等的影響尚未見報告。

多刺裸腹溞屬于甲殼綱、枝角亞目、裸腹溞屬，是許多淡水生態系統的重要組成部分。由于其生命周期短，對污染物敏感性強，能通過孤雌生殖獲得純系，因此被廣泛用于水體污染物的毒性監測和生態毒理學研究[25-28]。近幾年來，以其為受試生物開展枝角類連續世代的毒理學研究在逐漸增多[26-29]。本文以多刺裸腹溞為研究對象，研究了紅霉素對其連續3個世代(F0、F1和F2)生活史參數的影響，旨在彌補國內外此方面研究之不足，揭示紅霉素毒性隨其孤雌生殖世代數增加而變化的規律。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

受試動物：試驗用多刺裸腹溞(Moinamacrocopa)由香港科技大學提供，在(25±1) ℃、自然光照的恒溫培養箱內進行克隆培養。培養時，以EPA(通過溶解96 mg NaHCO3、60 mg CaSO4、60 mg MgSO4和4 mg KCl于1 L蒸餾水中配制而成)[30]為培養液，以用HB-4培養基[31]培養的、處于指數增長期的斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)為食物。斜生柵藻離心濃縮并經顯微計數后使用，投喂密度為1.0×106cells·mL-1[32]。

實驗藥品：試驗用紅霉素(純度≥98%)購于Sigma-Slarbio公司。實驗前，用丙酮將紅霉素配制成1 g·L-1的原液，然后用蒸餾水稀釋成10 mg·L-1的母液，母液每周更換1次。實驗時用EPA將母液配制成所需要的濃度。

1.2 多刺裸腹溞生活史實驗方法

依據紅霉素對多刺裸腹溞存活和生殖的7 d-NOEC值為50 mg·L-1 [8]，實驗將紅霉素濃度設置為6個梯度，分別為0.02、0.2、2、20、200和2 000 μg·L-1，另設空白對照組和丙酮(助溶劑)對照組(其中丙酮含量與2 000 μg·L-1濃度組中的含量相同，為0.5‰)。實驗在與預培養相同的條件下進行。實驗選取多刺裸腹溞各世代于第3窩所產的幼體(齡長<12 h)進行；其中，F0代幼體為預培養狀態下多刺裸腹溞在第3代第3窩所產的雌性幼體，F1代幼體為F0代在實驗狀態下第3窩所產的雌性幼體，F2代幼體為F1代在實驗狀態下第3窩所產的雌性幼體。實驗在6孔培養板內進行，每孔加入10 mL測試液(內含密度為1.0×106cells·mL-1的斜生柵藻)和1只多刺裸腹溞幼體，每個濃度設12個重復。實驗開始后，每天更換50%測試液一次(內含密度為1.0×106cells·mL-1的斜生柵藻)，每12小時觀察并記錄1次多刺裸腹溞的存活數、繁殖窩數和每窩所產的幼體數，并移出幼體。實驗持續到所有原初個體死亡為止；死亡標準以晃動杯子15 s不動為準[8,33]。

表1 連續3個世代暴露于不同濃度紅霉素溶液中多刺裸腹溞的存活和生殖參數(平均值±標準誤)Table 1 Parameters of survival and reproduction of three successive generations of M. macrocopa exposed to different erythromycin concentrations (Mean±SE)

注：*與各世代的空白對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。Note: *significantly different from the blank controls in each generation (P<0.05).

1.3 數據處理方法

采用SPASS 19.0分析軟件對各生活史參數進行統計分析。對符合正態分布的數據進行單因素、雙因素方差分析和多重比較(LSD檢驗)，以揭示不同紅霉素濃度、世代數以及它們之間的交互作用對多刺裸腹溞各生活史參數影響的顯著性。

2 結果(Results)

與空白對照組相比，暴露于0.5‰的丙酮(助溶劑)溶液中多刺裸腹溞，除了F1代和F2代的首次生殖年齡顯著減小了13.73%和16.00%外(P<0.05)，3個世代多刺裸腹溞的其他各生活史參數均未出現顯著性差異(P>0.05)(表1)。

2.1 紅霉素濃度對連續3個世代多刺裸腹溞存活的影響

紅霉素濃度對多刺裸腹溞F0代平均壽命的影響表現出“低促高抑”的劑量-效應關系(P<0.05)，但其對平均壽命影響的顯著性隨著多刺裸腹溞世代數的增加而消失(P>0.05)。與空白對照組相比，暴露于0.02 μg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F0代的平均壽命延長了10.26%(P<0.05)，但暴露于2～2 000 μg·L-1紅霉素溶液中的F0代的平均壽命則縮短了25.87%～54.84%(P<0.05)；暴露于各濃度紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F1和F2代的平均壽命均未出現顯著性差異(P>0.05)(表1)。

2.2 紅霉素濃度對連續3個世代多刺裸腹溞首次生殖年齡的影響

紅霉素濃度對多刺裸腹溞F0代的首次生殖年齡無顯著性影響(P>0.05)，但卻顯著地影響了多刺裸腹溞F1和F2代的首次生殖年齡(P<0.05)。與空白對照組相比，暴露于0.2、20～2 000 μg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F1代的首次生殖年齡減小了4.90%～15.69%(P<0.05)，暴露于0.2～2 000 μg·L-1紅霉素溶液中的F2代的首次生殖年齡減小了5.00%～16.00%(P<0.05)(表1)。

2.3 紅霉素濃度對連續3個世代多刺裸腹溞生殖窩數、窩卵數和總后代數的影響

與空白對照組相比，暴露于20 μg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F0代的生殖窩數減小了55.76%(P< 0.05)，但暴露于各濃度紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F1和F2代的生殖窩數并未出現顯著性差異(P>0.05)。

表2 紅霉素濃度對連續暴露3個世代的多刺裸腹溞的存活和生殖參數的影響(雙因素方差分析)Table 2 Effects of erythromycin (ER) concentration on parameters of survival and reproduction of three successive generations of M. macrocopa (Two-way ANOVA)

紅霉素濃度對多刺裸腹溞窩卵數的顯著性影響只出現在F1代(P<0.05)，表現為與空白對照組相比，暴露于20和200 μg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F1代的窩卵數分別增加了28.87%和10.18%(表1)。

紅霉素濃度對多刺裸腹溞總后代數的顯著性影響出現在F0和F1代(P<0.05)，在F2代中消失(P>0.05)。與空白對照組相比，暴露于2～200 μg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F0代的總后代數減少了43.99%～62.21%(P< 0.05)，而暴露于20和200 μg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F1代的總后代數分別增加28.56%和37.17%(P<0.05)(表1)。

雙因素方差分析結果表明，多刺裸腹溞的平均壽命、首次生殖年齡和生殖窩數受世代數、紅霉素濃度以及兩者間的交互作用的顯著影響，窩卵數受世代數和紅霉素濃度間交互作用的顯著影響，總后代數受世代數以及世代數和紅霉素濃度間交互作用的顯著影響(表2)。

3 討論(Discussion)

3.1 助溶劑對枝角類生活史參數的影響

丙酮的毒性在各種有機溶劑中最低，所以丙酮是水生態毒理學試驗中一種常用的有機溶劑[34-35]；但在水生態毒理學試驗中，丙酮對受試生物的影響并非可以完全忽視。Sánchez等[36]發現，與空白對照組相比，10-4μg·L-1的丙酮對大型溞母代和F1代第1窩個體所有生活史參數均無顯著性影響，但卻提高了F1代第3窩個體的窩卵數和總后代數。Chu等[37]也發現與空白對照組相比，丙酮對多刺裸腹溞的繁殖具有促進作用；推測其原因可能是細菌以丙酮為補充營養源，進而為枝角類提供更多的食物。陳艷等[27]研究發現，與空白對照組相比，0.5‰的丙酮對多刺裸腹溞F0生命表參數無顯著性影響，但卻顯著提高了F1代和F2代的種群內稟增長率。本研究發現，與空白對照組相比，0.5‰的丙酮對多刺裸腹溞F0代的存活和生殖均無顯著性影響，但卻顯著縮短了多刺裸腹溞F1和F2代的首次生殖時間。

3.2 污染物濃度與浮游動物生活史參數之間的劑量-反應關系

低污染物濃度范圍內的劑量-反應性質一直是毒理學研究中最具挑戰的話題之一[38]。越來越多的證據表明這類劑量-反應關系呈“U”形，表現為毒物刺激效應(hormesis)，以“低促高抑”為特征[38]。低濃度的艾氏劑(aldrin)、十氯丹(chlordecone)和鄰苯二甲酸丁芐酯促進萼花臂尾輪蟲的種群增長[39-41]；1.0×106cells·mL-1的斜生柵藻密度下，6.0 μg·L-1的Hg2+促進萼花臂尾輪蟲的存活、生殖和種群增長[42]；一定濃度的艾氏劑促進多刺裸腹溞F2代的種群增長[27]。本研究中，毒物刺激效應也是明顯的，主要表現為與對照組相比，暴露于0.02 μg·L-1的紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F0代的平均壽命顯著延長，暴露于0.2、20～2 000 μg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F1代的首次生殖年齡顯著減小，暴露于20和200 μg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F1代的窩卵數和總后代數顯著增加。低濃度的污染物可能刺激了多刺裸腹溞的攝食，因此促進了它的存活、發育和生殖；而高濃度的污染物可能減少了多刺裸腹溞的攝食，加之污染物的毒性作用，由此抑制了它的存活、發育和生殖。

Ji等[8]研究發現，與對照組相比，21 d慢性毒性暴露后，暴露于100和300 mg·L-1紅霉素溶液中的大型溞的存活率顯著降低，暴露于33.3 mg·L-1紅霉素溶液中的大型溞的窩卵數和總后代數顯著減少，但暴露于3.7～33.3 mg·L-1紅霉素溶液中的大型溞的首次生殖時間未出現顯著性差異；暴露于400和1 600 μg·L-1紅霉素硫氰酸鹽溶液中的大型溞的壽命顯著縮短，暴露于1 600 μg·L-1紅霉素硫氰酸鹽溶液中的大型溞的首次生殖年齡顯著縮短，暴露于400、800和1 600 μg·L-1紅霉素硫氰酸鹽溶液中的大型溞的生殖窩數和總后代數顯著減少[17]；7 d慢性毒性暴露后，暴露于150 mg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞的存活率顯著降低；但暴露于1.85～50.0 mg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞的首次生殖時間、窩卵數和總后代數均無顯著變化[8]。由于慢性毒性試驗持續的時間和測試的紅霉素濃度范圍等不同，本研究所得到的結果也與上述結果之間有所不同。本研究結果顯示，與空白對照組相比，暴露于0.02 μg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F0代的平均壽命顯著延長了，但暴露于2～2 000 μg·L-1紅霉素溶液中的F0代的平均壽命顯著縮短；暴露于20 μg·L-1紅霉素溶液中的F0代的生殖窩數顯著減小，暴露于2～200 μg·L-1紅霉素溶液中的F0代的總后代數顯著減少。

3.3 污染物濃度對枝角類生活史參數影響的世代間差異

已有研究結果表明，枝角類的存活和生殖等對污染物的響應因孤雌生殖世代數或窩數的不同而異。如21 d慢性毒性暴露后，大型溞的平均壽命、首次生殖年齡、生殖窩數、窩卵數和總后代數對二嗪農濃度的響應在F0代、F1代第1窩和第3窩個體間明顯不同[36]；完全生命周期慢性暴露后，多刺裸腹溞的生命期望和凈生殖率對升高的艾氏劑濃度的反應以及平均壽命、首次生殖年齡和總后代數對升高的壬基酚濃度的反應均在F0、F1和F2代之間存在著顯著的差異[27, 29]；一定濃度的鄰苯二甲酸丁芐酯使多刺裸腹溞F0代的生命期望和凈生殖率顯著降低，但對F1代卻無顯著性影響[28]；200.0 μg·L-1的氧氟沙星和900.0 μg·L-1的布洛芬對大型溞繁殖的影響表現出世代差異性[43]。與上述結果一致，本研究中，紅霉素濃度對多刺裸腹溞的平均壽命、首次生殖年齡、生殖窩數、窩卵數和總后代數的影響在多刺裸腹溞世代間也均存在著差異。

大型溞前幾代在生殖方面表現出對200.0 μg·L-1的氧氟沙星和900.0 μg·L-1的布洛芬一定的適應性或耐受性[43]。本研究結果表明，多刺裸腹溞F1和F2代在存活、F2代在生殖等方面對各濃度的紅霉素也表現出一定的適應性或耐受性。當然，更多世代的多刺裸腹溞對紅霉素污染的響應仍需要進一步的研究。