野生金針菇的分子鑒定及遺傳多樣性分析*

黃龍花，譚武平，劉遠超，黃志勇，鐘元茂，史 釧，胡惠萍**

（1.廣東省微生物研究所，省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東 廣州 510070；2.廣東粵微食用菌技術有限公司，廣東 廣州 510663）

金針菇隸屬于口蘑科（Tricholomataceae）冬菇屬（Flammulina），含有豐富的大分子物質，如多糖和糖蛋白，具有提高免疫力、抗癌和抗病毒的功效[1-2]，而且味道鮮美，因此成為重要的食（藥）用菌，金針菇已成為工廠化生產的主栽種類。其子實體需要在低溫8℃～14℃條件下生長[3]，工廠化生產因降溫所產生的能耗成本很高，因此，選育適宜高溫生長的金針菇品種，成為金針菇育種的重要研究方向[4-6]。野生金針菇資源的基因型差異為育種提供了豐富的遺傳材料，因此研究野生金針菇種質資源的遺傳多樣性，對今后金針菇育種和菌種知識產權的保護，具有重要的意義。

ITS（internal transcribed spacer）是核糖體DNA上一個非編碼區，為中度保守序列，在物種進化過程中，受到的選擇壓力較小，允許更多的變異，進化速度很快，因而可以提供大量的變異位點和信息位點[7]。ITS不僅在物種鑒定上廣泛應用，同時也可以對種內差異進行分析[8]。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

所有供試菌種見表1，11個野生分離種采集自全國各自然保護區，2個市場流通栽培種購自福建某菜市場，13株金針菇菌種都是廣東省微生物所食用菌研究發展中心采集或購買并分離純化的。

1.2 方法

1.2.1 傳統形態鑒定

通過肉眼觀察標本的菌蓋、菌褶、菌柄形態、顏色和附屬物。同時用顯微鏡觀察子實體的微觀特征：選取待觀察的組織，置于5%KOH溶液中觀察擔子、擔孢子、囊狀體、蓋皮層組織的形態、大小以及顏色反應；參考分類工具書以及新近的研究成果進行形態學分類鑒定[9-14]。

表1 菌種來源及序列登錄號Tab.1 Species and their GenBank accession number

1.2.2 PDA 培養基

馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨5 g、KH2PO41 g、瓊脂15 g，定容至1 L。

1.2.3DNA 提取

將菌絲接種到貼有玻璃紙的PDA培養基上，于25℃培養7 d～10 d后收集新鮮菌絲作為DNA提取材料，使用天根生化科技（北京）有限公司的DP305 DNA提取試劑盒，按說明書操作，得到的基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存備用。

1.2.4 PCR 擴增

采用通用引物ITS1和ITS4[15]（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）進行PCR擴增，引物由Sangon公司合成。Taq酶購自Sangon公司。50 μL反應體系：模板DNA 10 ng～100 ng，ITS1（10 μmol·L-1）2 μL，ITS4（10 μmol·L-1）2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，Mg2+（25 mM）3 μL，dNTP（each 10 mmol·L-1）1 μL，Taq DNA Polymerase（5U·μL-1）1 μL，ddH2O補齊到50 μL。擴增程序：94℃預變性4 min；94℃變性30 s；55℃退火45 s；72℃延伸1 min，共35個循環；72℃延伸10 min。產物于1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。1.2.5 克隆測序及序列分析

PCR產物純化后進行T-A克隆測序，所得序列在NCBI上進行Blast相似性搜索，確定目標序列，根據GenBank中已報道的金針菇ITS序列（Accession No.DQ978220.1） 和“The ITS2 Database”數據庫，確定所有金針菇樣品的rDNA-ITS序列中ITS1和ITS2與3個編碼區18S、5.8S和28S的界限。去除兩側多余序列，只保留ITS1、5.8S和ITS2用于分析。用Clustal W進行序列比對對齊，MEGA Version 6.0進行序列信息位點的統計分析、遺傳距離計算和系統發育樹的構建，按照Neighbor-joining法，基于Kimura雙參數模型，以香菇（Lentinula edodes） 作為外類群，用自展法（Bootstrap，1 000次循環）檢驗各分支的置信度。

2 結果

2.1 傳統形態鑒定

傳統形態學分類鑒定可將13個試驗菌株分為3個菌種：Flammulina rossica，柳生金針菇，也叫淡色冬菇；Flammulina fennae，國內少見記載，目前尚無通用中文名，在本研究中被李泰輝教授命名為“芬娜金針菇”；Flammulina velutipes，金針菇，也叫冬菇、毛柄金錢菌、樸菰等。

2.2 rDNA ITS序列

經軟件處理，所有試驗菌株ITS序列信息見表2。13個金針菇樣品的ITS序列（只包含ITS1、5.8S rDNA和ITS2） 長度變化范圍在698 bp～718 bp，相差20 bp，ITS序列最短的菌株是M140658，最長的是S140014。5.8S rDNA長度為156 bp，高度保守，所有樣品只有1個位點的差異，其中E141531、W141696、W141699、N140925在相同位點出現1個AT→CG轉換（transition）。

結果顯示，ITS1序列長度范圍246 bp～250 bp，只相差4 bp，堿基 A占 19.9%，堿基 T占 32.6%，堿基C占25.4%，堿基G占22.1%，各基因型（G+C） 含量差異不大，最低為46.8%，最高為49.6%。當空位（gap）作缺失處理時，ITS1區全序列排序后的長度為261個位點，最長空位（gap） 相差10 bp，共有35個變異位點（variable sites），占總位點的13.4%，22個簡約信息位點（parsimony informative sites），占總位點的 8.4%。

表2 實驗菌株的ITS序列信息Tab.2 The ITS sequence information of test samples

ITS2序列長度在296 bp～314 bp，相差18個堿基，長度方面ITS1區變化更大，堿基A占16.1%，堿基 T占 31.4%，堿基 C占 26.3%，堿基 G占26.2%，各基因型（G+C） 含量總體高于ITS1區域，變幅為 51.7%～53.2%。當空位 （gap） 作缺失處理時，ITS2區全序列排序后的長度為319個位點，最長空位（gap） 樣品M140658相差15 bp，共有27個變異位點，占總位點的8.5%，17個簡約信息位點，占總位點的5.0%。

2.3 菌株間遺傳距離計算和系統發育樹構建

2.3.1 遺傳距離

根據Kimura雙參數方法計算全國11個野生金針菇和2個栽培金針菇菌株遺傳距離，結果見表3。

由表3可知，13個金針菇種間遺傳距離在0～0.045，其中Flammulina velutipes種內遺傳距離較小（0～0.008），Flammulina rossica 種內遺傳距離較大（0.002～0.014）。而黑龍江日月峽的 Flammulina velutipes與黑龍江五營的Flammulina rossica遺傳距離最大，為 0.045。

2.3.2 系統發育樹

按照Neighbor-joining法，基于Kimura雙參數模型，以香菇（Lentinula edodes） 作為外類群，用自展法（Bootstrap，1 000次循環）檢驗各分支的置信度。將13個金針菇與GenBank上公布的國內外其他金針菇菌株的ITS序列進行比對，分析他們的系統發育關系，結果見圖1。從圖1可知，所有試驗菌株可以分為3個不同的種：柳生金針菇（Flammulina rossica）、芬娜金針菇（Flammulina fennae）、金針菇（Flammulina velutipes）。Flammulina velutipes以 98%的可信度聚在一起形成一個分支，這一分支與Flammulina rossica和Flammulina fennae組成的單系分支構成姐妹群，其中Flammulina rossica以99%的可信度聚成1個分支，而2個Flammulina fennae以90%的可信度聚成1個分支。

表3 13株金針菇ITS序列的遺傳距離矩陣Tab.3 The genetic distance matrix of ITS sequences of thirteen Flammulina sp.

野生金針菇的地域差異，在系統發育樹中同樣得到很好的支持。黑龍江采集的E141531、W141696、W141699以81%的可信度聚在一起；四川省采集的E141870、N140864和N140951以87%的可信度聚在一起；湖南莽山的S140014菌株與廣東南嶺的N140982菌株以84%的可信度聚在一起，說明親緣關系很近，遺傳距離為0.002，這是因為湖南莽山和廣東南嶺本就是同一山脈，只因被省界隔開而出現不同名稱；另外，內蒙古采集的M140658單獨構成1個分支。系統發育樹表現出金針菇的種屬差異和地域差異，說明ITS1-5.8S-ITS2 rDNA可以用于鑒別金針菇的遺傳關系。

3 討論

圖1 基于ITS序列構建的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on ITS sequences

在系統學分析中，ITS1或ITS2的序列可作為單獨的片段進行系統發育分析[16]，但是更多的研究者是將2個片段綜合考慮[17-19]。

本研究中13個金針菇樣品，ITS1-5.8S-ITS2片段長度均在710 bp左右，ITS1和ITS2序列的變異位點數分別為35個和27個，占總位點的13.4%和8.5%，且ITS1序列的簡約信息位點也多于ITS2序列，分別占總位點的8.4%和5.0%，這表明金針菇ITS1序列變異明顯大于ITS2序列。因此，如果采用單個區間分別對不同金針菇種進行系統發育分析，選擇ITS1序列更適合。不同物種間可能存在差異，王化坤[20]的研究發現桃、李、櫻桃的ITS1序列變異位點高于ITS2序列，而梅的ITS1序列變異位點低于ITS2序列。本研究中，采集到的菌株種類和采集地域有限，在擴大采樣群體后，菌株的信息位點和變異位點都有可能增加。

通過構建系統發育樹，種屬差異和地域差異都得到了很好的體現。四川的Flammulina rossica樣品與黑龍江的Flammulina rossica樣品分別聚在2個小分支，四川的樣品采集地均在海拔3 000 m以上，采集時平均溫度在8℃左右，而黑龍江的樣品采集時平均氣溫為20℃左右，有望開發成耐高溫金針菇品種。內蒙古采集的Flammulina fennae單獨聚在1個分支，目前尚無中文名，因似少女的纖細體型，由李泰輝教授命名為“芬娜金針菇”，經馴化發現，該株金針菇出菇溫度較高，商品性狀好（菌柄細長筆直、長度均勻；菌蓋小而均勻；菌柄基部不粘黏），具有較好的開發利用價值。野生菌種的遺傳多樣性為金針菇的優良新菌種選育提供了豐富種質資源。

4 結論

通過對采自全國7個自然保護區共計11個野生金針菇和2個常見栽培金針菇菌株，進行ITS-PCR和產物測序。基于ITS序列進行菌株的遺傳距離分析和系統發育分析，結果顯示，金針菇的ITS1序列比ITS2序列進化速率快，變異位點和簡約信息位點差異較大；13株金針菇種內遺傳距離為0～0.014，種間遺傳距離為 0.029～0.045；ITS 系統發育樹支持將13個菌株分為3個類群，且相同菌種地域越近則親緣關系也越近。