十八味訶子利尿丸中姜黃的HPLC定性定量研究

段廣佩 張幸福

（1青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院 青海 西寧 810016）

（2青海省中藏藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青海 西寧 810016）

十八味訶子利尿丸是以訶子、姜黃、余甘子、紅花等十八味中藏藥材制成的復(fù)方制劑，主要功效為益腎固精、利尿，用于腎病、糖尿病、遺精等癥[1]。研究表明其對(duì)通?？股仉y抑制的耐藥菌和真菌抑制效果較好,尤其是對(duì)白色念珠菌抑制效果最好[2]。姜黃的主要活性成分為姜黃素，姜黃素為橙黃色結(jié)晶粉末，經(jīng)醫(yī)學(xué)研究，姜黃素具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化等作用，國(guó)際上近年對(duì)其研究愈加重視[3-5]。本文建立了十八味訶子利尿丸中姜黃的HPLC定性方法，并對(duì)姜黃素進(jìn)行了HPLC定量測(cè)定。定性鑒別方法專屬性強(qiáng)，定量方法準(zhǔn)確，可有效控制該藥中姜黃的質(zhì)量。

1.儀器與材料

島津高效液相色譜儀（LC-20ATVP型）；電子天平(SartriousBT224S,德國(guó)Sartrious公司)；電子天平(XS105DU，德國(guó)Sartrious公司)，超聲波清洗器（KQ5200B，昆山市超聲儀器有限公司）；姜黃素（供含量測(cè)定用，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)）。乙腈為色譜純（市售），其余試劑為分析純（市售），水為超純水。十八味訶子利尿丸樣品十批，分別來自青海格拉丹東藥業(yè)有限公司等7家企業(yè)。

2.方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[6-8]

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；色譜柱：ZORBAX Eclipse×DB—C18（250mm×4.6mm）；4%冰醋酸溶液-乙腈(54:46)為流動(dòng)相；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為430nm。理論板數(shù)按姜黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于10000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取姜黃素對(duì)照品0.00545g，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻（每1ml含姜黃素0.0545mg），即得儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液10ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液（每1ml含姜黃素0.0109 mg）。

2.3 姜黃對(duì)照藥材溶液的制備

取姜黃粗粉約50mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流40分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 供試品溶液的制備

取本品細(xì)粉約0.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流40分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 陰性溶液的制備

按處方比例稱取除去姜黃以外的其他藥材適量，依照十八味訶子利尿丸供試品溶液的制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。

2.6 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

利用高效液相色譜-二極管陣列(DAD),根據(jù)姜黃素的光譜圖進(jìn)行選擇,姜黃素在430±2nm處有最大吸收，因此選擇430nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.7 測(cè)定法

按上述色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品溶液、姜黃對(duì)照藥材溶液、供試品溶液、陰性溶液各10μl，分別注入液相色譜儀。供試品溶液色譜圖中，在與姜黃素對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上，有相同的色譜峰；在與姜黃對(duì)照藥材色譜峰相應(yīng)的位置上，有保留時(shí)間相同的三個(gè)相鄰的主色譜峰；而陰性溶液在此無干擾。色譜圖見圖。

圖 十八味訶子利尿丸中姜黃素色譜圖

2.8 線性關(guān)系考察

取上述已配制好的姜黃素（濃度為0.0109mg/ml）對(duì)照品溶液。在上述色譜條件下，測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為：y=7930626.771035X-3382.771035，R=1.0000；結(jié)果表明姜黃素進(jìn)樣量在0.0109～0.3866μg的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，見表。

2.9 精密度試驗(yàn)

精密吸取姜黃素對(duì)照品溶液（濃度為0.0109mg/ml），連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣量為10μl,測(cè)得姜黃素峰面積，平均值859005。表明姜黃素精密度良好，RSD為0.54%（n=6）。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液（青海省格拉丹東藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)0907108，），于不同時(shí)間內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定峰面積，結(jié)果表明供試品中姜黃素在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD為1.30%（n=12）。

2.11 重復(fù)性試驗(yàn)

取十八味訶子利尿丸細(xì)粉（西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)20100101，），精密稱取6份，按上述方法制成供試品溶液并測(cè)定姜黃素含量，結(jié)果該份樣品平均含量0.6227%，結(jié)果表明：供試品重現(xiàn)性良好。RSD為1.7%。

2.12 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密吸取1.70ml姜黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液（0.0545mg/ml）各6份，置100ml錐形瓶中，蒸干溶劑。取已知含量的十八味訶子利尿丸樣品約0.25g（西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)20100101，姜黃素含量為0.6227mg/g），精密稱定，分別置上述錐形瓶中，制成供試品溶液，并按上述色譜條件測(cè)定姜黃素的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為100.04%，RSD=1.06%，回收較好。

2.13 樣品含量測(cè)定

取所有樣品細(xì)粉，照上述方法制成供試品溶液。按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算姜黃素的含量。測(cè)定結(jié)果見表。

表 樣品姜黃素測(cè)定結(jié)果

2.14 藥材的測(cè)定

取7個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的姜黃藥材細(xì)粉，照上述方法制成供試品溶液。按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果6家生產(chǎn)企業(yè)的姜黃藥材出現(xiàn)保留時(shí)間一致的三個(gè)色譜峰，姜黃素含量范圍為0.65%～1.39%

2.15 十八味訶子利尿丸中姜黃的HPLC鑒別

取“2.2”和“2.4”項(xiàng)下的供試品溶液和對(duì)照品溶液，另取姜黃對(duì)照藥材粗粉約50mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流40分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。按上述色譜條件進(jìn)樣。供試品溶液色譜中，在與姜黃素對(duì)照品色譜保留時(shí)間一致的位置上，有相同的色譜峰；在與姜黃對(duì)照藥材色譜峰相應(yīng)的位置上，有保留時(shí)間相同的三個(gè)相鄰的主色譜峰；而陰性溶液在此無干擾。

3.討論

對(duì)姜黃藥材按藥材做了原粉和水煮兩種方法的考察，結(jié)果表明水煮會(huì)使姜黃素含量降低約14倍。

通過比較姜黃素的含量后發(fā)現(xiàn)，不同企業(yè)所生產(chǎn)的十八味訶子利尿丸中姜黃色含量存在一定差異。

對(duì)樣品進(jìn)行的HPLC鑒別結(jié)果表明，大多數(shù)廠家的樣品中，均出現(xiàn)與姜黃對(duì)照藥材保留時(shí)間一致的三個(gè)色譜峰，且陰性無干擾，部分企業(yè)所提供的姜黃藥材和十八味訶子利尿丸中只出現(xiàn)姜黃色的色譜峰，表明企業(yè)所用姜黃藥材需要進(jìn)一步考察。