不同濃度甘精胰島素對人皮下前脂肪細胞分化和脂質代謝的影響

李匯涓 徐 勝 肖和衛

(廣西壯族自治區人民醫院，廣西 南寧 530021)

脂肪組織不僅是能量儲存器官，也是內分泌器官，能夠分泌瘦素、脂聯素、腫瘤壞死因子(TNF)-α、視黃醇結合蛋白(RBP)4等細胞因子，參與動脈粥樣硬化、胰島素抵抗等代謝性疾病的發生〔1〕。甘精胰島素作為糖尿病治療的一線藥物，廣泛應用于臨床治療。相關研究發現，甘精胰島素能夠糾正糖尿病患者體內血脂代謝紊亂〔2〕，但機制仍未明確。本實驗擬分析不同濃度甘精胰島素對人皮下前脂肪細胞分化和脂質代謝的影響及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 脂肪組織來于廣西壯族自治區人民醫院行開腹手術的6例患者，男2例、女4例，年齡50.17歲，術前行口服糖耐量試驗排除糖尿病，排除嚴重感染、重要器官和系統功能不全者，本研究經醫院倫理委員會審批，組織取材均經患者知情同意。主要試劑：胎牛血清、DMEM培養基、Ⅰ型膠原酶均購于北京北方同正生物技術發展有限公司；脂肪因子檢測試劑盒、Trizol試劑盒均購于上海廣銳生物科技有限公司。

1.2前脂肪細胞原代培養基鑒定 術中取患者腹部皮下脂肪組織約15 g，磷酸緩沖液洗滌后剪碎，Ⅰ型膠原酶消化，接種至含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養24 h，光學顯微鏡下觀察細胞生長情況。消化傳代，取3～5代對數期前脂肪細胞，流式細胞術檢測表面抗原(CD44、CD105、CD31、CD34)，鑒定培養的前脂肪細胞相關生物活性。

1.3誘導分化及甘精胰島素干預 取5～8代對數期前脂肪細胞，調整細胞濃度至1×106/ml接種至6孔板，待細胞完全覆蓋后加入無血清分化培養基，前3 d加1 mmol/L的成脂誘導分化劑3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，誘導2 w后，油紅O染色鑒定成脂分化；分化過程中分別加入濃度為125、250、500、1 000 nmol/L的甘精胰島素進行干預，每3 d收集上清液。

1.4脂肪因子檢測 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測分化第3、7、14天前脂肪細胞上清液中脂肪因子瘦素、脂聯素、TNF-α、RBP4水平；比色法檢測前脂肪細胞中脂質代謝指標三酰甘油含量及甘油釋放量；具體操作嚴格按試劑盒說明進行。

1.5qRT-PCR檢測目的基因表達 Trizol法提取前脂肪細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ、促進結合蛋白(CEBP)α、RBP4、激素敏感性酯酶(LPL)、β-actin引物由上海滬宇生物科技有限公司設計合成。SYBR GREEN Ⅰ染料法在熒光定量PCR儀上擴增，總反應體系20 μl，反應條件：95℃ 40 s;95℃ 10 s;60℃ 30 s;72℃ 1 min，共40個循環。擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳，2-△△Ct計算目的基因mRNA相對表達量。

1.6統計學分析 使用SPSS21.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1前脂肪細胞鑒定及誘導分化 流式細胞術檢測顯示，干細胞表面標志物CD44、CD105呈強陽性，表達率超過97%，而內皮細胞標志物CD31、CD34呈陰性，說明培養的原代前脂肪細胞具有干細胞特性。前脂肪細胞經IBMX成脂誘導分化2 w，細胞呈圓形，胞內可見透亮脂滴填充，部分細胞間相互融合成片；胞內脂滴可被油紅O染呈橘紅色，見圖1。

2.2不同濃度甘精胰島素對脂肪因子的影響 隨著脂肪細胞逐漸分化成熟，瘦素、脂聯素分泌量明顯增加，TNF-α、RBP4分泌量明顯減少。分化第7和14天時，不同濃度組瘦素、脂聯素、TNF-α、RBP4分泌量差異均有統計學意義(P<0.05)，中濃度甘精胰島素(250、500 nmol/L)對瘦素、脂聯素分泌的促進作用，對TNF-α、RBP4分泌的抑制作用最明顯。見表1。

2.3不同濃度甘精胰島素對脂質代謝的影響 隨著脂肪細胞逐漸分化成熟，胞內三酰甘油含量逐漸增加；甘精胰島素250、500 nmol/L組三酰甘油含量明顯高于125、1 000 nmol/L組(P<0.05)。脂質合成的同時伴隨脂質分解，胞內甘油釋放量隨分化時間的變化不明顯，與甘精胰島素的干預濃度呈正比，甘精胰島素1 000 nmol/L組甘油釋放量明顯高于125、250、500 nmol/L組(P<0.05)。見表2。

2.4前脂肪細胞分化過程中基因轉錄水平變化 隨脂肪細胞分化時間延長，各目的基因轉錄水平逐漸增加，不同時間點PPAR-γ、CEBPα、RBP4、LPL mRNA相對表達量差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表1 不同濃度甘精胰島素對各分化時間脂肪因子分泌水平的影響

與甘精胰島素125 nmol/L組比較：1)P<0.05；與250 nmol/L組比較：2)P<0.05；與500 nmol/L組比較：3)P<0.05

表2 不同濃度甘精胰島素對脂質合成和分解的影響

與甘精胰島素250、500 nmol/L組比較：1)P<0.05;與甘精胰島素1 000 nmol/L組比較：2)P<0.05

表3 前脂肪細胞分化不同時間點各目的基因mRNA表達水平

與0、3、7 d比較：1)、2)、3)P<0.05

3 討 論

近年來，肥胖被歸為慢性炎癥疾病范疇，脂肪組織可通過分泌多種細胞因子參與糖尿病、動脈粥樣硬化等發生〔3〕。本實驗結果顯示，隨著前脂肪細胞分化成熟，瘦素、脂聯素、TNF-α、RBP4分泌量均明顯增加，中濃度甘精胰島素對脂肪因子分泌的促進效果最明顯。相關研究顯示，胰島素可促進小鼠L1細胞中脂聯素的分泌〔4〕。高胰島素血癥、慢性炎癥存在于2型糖尿病或肥胖患者中，導致促炎性脂肪因子(TNF-α、RBP4)分泌量增加，當給予胰島素治療后，促炎性脂肪因子分泌量減少，抗炎脂肪因子(瘦素、脂聯素)分泌量增加，進一步從體外細胞實驗證明了胰島素在人體中的抗炎作用。細胞脂質代謝包括脂質的合成和分解，可分別通過細胞中三酰甘油含量和甘油釋放量來反映。相關研究顯示，上調PPAR-γ、CEBPα、RBP4、LPL基因表達可提升細胞中cAMP水平，進而促進PKA活性，誘發β腎上腺素受體信號傳導，促進脂肪降解〔5〕。本研究顯示，甘精胰島素是促進脂質合成的同時也能夠誘導脂肪分解，其中脂質合成與脂肪細胞分化進程有關，中濃度甘精胰島素對脂質合成的促進效果最明顯；但脂質分解與分化進程關系不大，與甘精胰島素濃度呈正相關，高濃度甘精胰島素促進脂質分解效果最明顯。進一步對前脂肪細胞分化不同時間點目的基因mRNA表達情況分析顯示，PPAR-γ、CEBPα、RBP4、LPL mRNA相對表達量隨分化時間延長明顯提升，可能參與甘精胰島素對脂肪細胞脂質代謝的調控。