地黃花多糖抗衰老作用及機制

李玉潔 韓倩倩 陳 鑫 徐慧穎 李寒冰 張明昊 趙珍珍

(河南中醫藥大學基礎醫學院，河南 鄭州 450046)

中藥地黃為玄參科多年生草本植物地黃的新鮮或干燥塊根〔1〕。以地黃為主的復方如：六味地黃、金匱腎氣丸均為歷代醫家用于溫補腎陽、延緩衰老的代表方劑〔2～9〕。地黃花為地黃的花蕾，有治消渴，腎虛腰痛等功效，《本草綱目》記載：“地黃花研末服用，功同地黃，如腎虛腰脊疼痛，將其研為末，用酒送服”〔10〕。秀麗隱桿線蟲(簡稱線蟲)是存在土壤中的一種低等生物。由于其易于飼養和保存、生長周期較短、繁殖快、進化過程中高度保守、遺傳信息清晰，與人類的同源性基因高達60%～80%等優點，使得線蟲成為抗衰老藥物、功能因子研究的理想模型〔11，12〕。本實驗探討地黃花多糖對線蟲壽命的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1一般材料 菌株與試劑大腸桿菌(Escherichia coli)OP50、野生型秀麗隱桿線蟲(C.elegans)為中國人民解放軍軍事醫學科學院惠贈；瓊脂粉及牛肉蛋白胨購自北京奧博星生物技術有限責任公司；地黃花采自河南焦作；超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒及考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。實驗儀器：MJX-250B-Z電熱恒溫培養箱上海博迅實業有限公司；SZ51解剖顯微鏡日本奧林巴斯；vd-850超凈工作臺江蘇蘇凈集團有限公司；MultiskanFC全波長多功能酶標儀美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2方法 將地黃花粉碎，過80目篩，稱取50 g，置于1 000 ml圓底燒瓶中，石油醚脫脂，濾渣加500 ml水煎煮2次，合并濾液，常溫減壓濃縮干燥，將干燥藥物配制成35%的水溶解，加95%乙醇，使乙醇終濃度為80%，靜置24 h，2 000 r/min離心5 min，下層沉淀物為地黃花粗多糖，干燥后稱重，提取率為11.94%。線蟲培養采用Brenner〔13〕的方法，將雌雄同體線蟲飼養于涂布大腸桿菌OP50(E.coliOP50)的線蟲標準培養基(NGM)上，20℃倒置培養。線蟲壽命測定于同期化后第4天，挑取大小一致的線蟲放入正常或含有3種不同的含藥培養基中培養。分為對照組、地黃花多糖低、中、高劑量組(25、50、100 mg/L)，以分組當天記為線蟲生命起始第0天，以取蟲器末端輕探蟲體無反應記為線蟲生命終止，從生命起始到終止時間記為線蟲壽命期。在線蟲壽命期內，每24 h將各平板上線蟲轉移至相同的新平板中，記錄各組線蟲存活及死亡數量，依據線蟲生存、死亡的條數繪制生存曲線。熱應激實驗將同期化幼蟲置于含或不含藥物的NGM板中，每組3個板，每板10條，48 h后，將線蟲置于35℃培養箱中觀察，每隔1 h記錄線蟲死亡、存活數目，連續觀察12 h，重復2次，死亡標準同壽命實驗。氧化應激實驗將同期化幼蟲置于含或不含藥物的NGM板中，每組3個板，每板10條，48 h后，將各組線蟲轉移到含有0.4 mmol/L過氧化氫(H2O2)的NGM培養基板中觀察，每隔1 h記錄線蟲存活數目，連續觀察12 h，重復2次，死亡標準同壽命實驗。生殖能力測定參照Onken等〔11〕的方法，每組挑取10條L4期的線蟲到含或不含藥物的NGM板中，每板放置2條線蟲。每隔24 h將線蟲轉移至新板中，直至線蟲生殖能力喪失。所有產卵板于20℃倒置培養24 h，記錄幼蟲數量，將每天產生的子代數目相加即為線蟲終身產卵量。SOD活性檢測將同期化幼蟲置于含或不含藥物的NGM板中，每個平板放入30～35只線蟲，每24 h將各平板上線蟲轉移至相同的新平板中，5 d后收集成蟲于EP管中，液氮中反復凍融3次提取線蟲蛋白，離心收集上清液，嚴格按照試劑盒說明書要求操作。

1.3統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行Kaplan-Meier法、One-Way ANOVA分析及LSD檢驗。

2 結 果

2.1各組線蟲壽命比較 與對照組相比，地黃花多糖低劑量組最大壽命明顯延長(P<0.05)，地黃花多糖中劑量組平均壽命及最大壽命均明顯延長(P<0.05)，地黃花多糖高劑量平均壽命及最大壽命均無明顯變化(P>0.05)，見表1。線蟲的生存曲線見圖1。

表1 地黃花多糖對線蟲壽命的影響

與對照組比較:1)P<0.05

圖1 地黃花多糖對線蟲生存曲線的影響

2.2各組熱應激條件下線蟲壽命比較 與對照組〔(7.30±0.29)h〕相比，地黃花多糖低、中、高劑量組平均壽命〔(10.77±0.24)h、(9.12±0.37)h、(8.56±0.39)h〕均顯著延長(P<0.01)。生存曲線見圖2。

圖2 地黃花多糖對熱應激條件下線蟲生存曲線的影響

2.3各組氧化應激條件下線蟲壽命比較 與對照組〔(7.05±0.42)h〕相比，地黃花多糖低、中劑量組平均壽命〔(8.74±0.70)h、(9.79±0.44)h〕極顯著延長(P<0.01)；地黃花多糖高劑量組〔(6.68±0.58)h〕與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。生存曲線見圖3。

圖3 地黃花多糖對氧化應激條件下線蟲生存曲線的影響

2.4各組生殖能力比較 與對照組〔(201.75±6.40)個〕相比，地黃花多糖低、中、高劑量組平均產卵數〔(187.53±22.46)個、(175.50±22.17)個、(132.83±11.68)個〕均有下降趨勢，其中地黃花多糖高劑量組顯著少于對照組(P<0.01)。

2.5各組SOD活性比較 與對照組〔(30.29±2.98)mg/L〕相比，地黃花多糖低、中劑量組SOD活性〔(50.96±4.55)、(49.84±1.83)、(23.49±6.22)mg/L〕顯著增強(P<0.05，P<0.01)；地黃花多糖高劑量組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

本文結果發現地黃花多糖低劑量及中劑量均可顯著延長線蟲的壽命，中劑量效果最好，隨著給藥劑量的繼續增大，作用降低，推測地黃花多糖抗衰老作用量效曲線呈倒“U”形。線蟲壽命的延長與壓力應激狀態下生存率提高具有很高的相關性，應激能力增強是線蟲壽命延長的原因之一〔14，15〕。本研究結果發現地黃花多糖各劑量均可顯著延長線蟲熱應激條件下的壽命，提高熱應激條件下線蟲的存活率。在體內和體外實驗中，H2O2能誘導活性氧生成增加，被廣泛用作誘導氧化應激模型〔11〕。本實驗結果發現地黃花多糖低劑量及中劑量對H2O2誘導的氧化有很強的保護作用，但隨著給藥劑量的繼續增大，作用效果降低，結果與壽命實驗結果一致。壽命與許多生理參數如：飲食量和生殖能力等密切相關〔16，17〕。本文結果推測，地黃花多糖發揮抗衰老作用可能與影響生殖能力有一定關系，但并非主要通過降低生殖能力發揮抗衰老作用，有待進一步研究。氧化應激是指機體受到刺激后，機體或細胞內自由基的產生和消除失衡，活性氧在細胞內蓄積，體內活性氧的積聚可造成機體氧化損傷，氧化損傷被認為是導致機體衰老的一個重要因素〔18,19〕。SOD作為體內主要的抗氧化物酶，在清除自由基方面發揮關鍵性作用〔20〕。本實驗結果推斷，地黃花多糖可能是通過提高線蟲體內SOD酶活性，進而降低體內活性氧水平而發揮抗衰老作用。隨著地黃花多糖用藥劑量的繼續增大，作用效果減弱，并顯示出一定副作用，據此推測地黃花多糖抗衰老作用的量效曲線呈倒“U”形，其抗衰老作用的發揮，可能與提高線蟲體內SOD酶活性，增強機體應激能力有關。