冠脈康顆粒對急性腦缺血小鼠腦組織炎癥因子的影響

高小明，鄒桂欣，張 穎*

0 引言

冠脈康顆粒(GMK)是我院國家級老中醫洪治平老師的臨床經驗方，由瓜蔞、丹參、葛根等中藥組成，具有活血化瘀、開胸祛痰之功效，臨床可以治療痰瘀阻絡型冠心病[1]。課題組前期研究發現，冠脈康膠囊[2](與GMK劑型不同)具有抗血栓形成、抗急性腦缺血作用。根據皮爾森相關系數可知，方中有12個化學組分與GMK抗缺血的藥效密切相關，其中瓜蔞(君藥)的化學成分多，貢獻最大[1]。藥理研究發現,腦缺血可影響多種炎性細胞因子，許多生化和分子基因學方面的實驗都證明了白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和前列腺素E2(PGE2)在腦缺血中的調節作用[3-5]。本研究旨在對GMK抗急性腦缺血作用進行研究，并對小鼠腦內IL-1β等相關細胞因子進行初步分析。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 昆明種小鼠(SPF)，體重18～22 g，由遼寧長生生物技術有限公司提供[SCXK(遼)2010-0001]。動物購買后飼養觀察1周，實驗室溫度：20～25 ℃，濕度：50%～60%。

1.1.2 實驗藥物與試劑盒 冠脈康顆粒由遼寧省中醫藥研究院藥學室提供；IL-1β、TNF-α、PGE2試劑盒購于南京建成生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 GMK對小鼠急性腦缺血的影響 取健康小鼠50只，雌雄各半，體重18～22 g，隨機分為5組，每組10只，即空白對照組(僅灌胃給予生理鹽水),冠脈康高、中、低劑量組(配制濃度為18.0、9.0、4.5 g/kg)，陽性對照組(心血寧0.66 g/kg)。灌胃，1次/d，連續7 d。于末次給藥30 min后，將各組小鼠于耳后2 mm處迅速斷頭，造成急性腦缺血，立即記錄小鼠斷頭后呼吸次數及持續時間。

1.2.2 GMK對小鼠全腦IL-1β、TNF-α和PGE2含量的影響 冰浴上剝離全腦，生理鹽水清洗后用濾紙吸干血液，稱重。加9倍冷PBS于電動勻漿器中研磨，4 ℃離心10 min，取上清液，酶標儀(450 nm)分別測定IL-1β、TNF-α、PGE2的OD值(具體步驟詳見試劑盒說明書，樣品孔及標準品孔為復孔)，計算含量。

2 結果

2.1 GMK對小鼠急性腦缺血呼吸次數和持續時間的影響 與空白對照組比較，GMK高劑量組和心血寧組小鼠斷頭后呼吸時間顯著延長，呼吸次數增加(P<0.05)，表明GMK具有改善急性腦缺血的作用。見表1。

表1 冠脈康顆粒小鼠斷頭缺血模型呼吸次數及持續時間比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05

2.2 GMK對小鼠全腦IL-1β、TNF-α和PGE2含量的影響 與空白對照組比較，灌胃給予小鼠GMK 18.0 g生藥/kg，連續7 d，能顯著降低小鼠全腦IL-1β、PGE2含量，差異有統計學意義(P<0.05)。TNF-α含量有降低的趨勢，但與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05),見表2。

表2 GMK對小鼠全腦IL-1β、TNF-α和PGE2含量的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05

3 討論

腦缺血的作用機制復雜，是一個由多種因素參與的級聯反應，腦缺血損傷后，腦內多種細胞參與了神經炎癥的發生、發展。腦內皮細胞以及被激活的白細胞所產生和釋放的炎性因子，如IL-1β和TNF-α等，可作為炎癥級聯反應的關鍵因子，通過損傷神經細胞、破壞血腦屏障、影響神經再生過程等多種途徑影響腦缺血損傷的過程[6-7]。

PGE2是廣泛存在于動物和人體內的花生四烯酸代謝產物，有研究認為，顱腦損傷可引起腦組織膜磷脂代謝障礙，花生四烯酸代謝瀑布被激活，環氧合酶2途徑產生的PGE2異常升高，在缺血性腦損傷中，PGE2與腦水腫的產生顯著相關[8]。

TNF-α是重要的致炎細胞因子，主要由活化的單核/巨噬細胞、肥大細胞及T淋巴細胞等多種炎癥細胞產生，具有廣泛的生物活性，能誘導炎癥和調節免疫功能。有報道，中樞神經系統內許多細胞均可分泌TNF-α，后者可能介入腦損傷后的多種病理生理反應[9]。給腦損傷動物模型注射TNF-α抗體，腦水腫和血腦屏障的損傷明顯減輕[10]。TNF能單獨或與其他細胞因子(如IL-1等)聯合激活巨噬細胞，產生一氧化氮。

IL-1β作為急性炎性因子，廣泛參與感染、缺血再灌注等病理過程，其主要來源于神經元、星形膠質細胞等，是腦缺血損傷炎性過程的關鍵因子[11-12]。有研究報道，大鼠瞬時腦缺血模型中IL-1β表達增高[13]，應用IL-1β注射大腦，可加重腦缺血[14]。腦缺血后，神經組織的IL-1β mRNA和TNF-α mRNA表達顯著升高[15]，呈正相關，推測IL-1β可能受TNF-α調節，共同參與缺血性腦損傷病理生理過程。

在GMK方中，君藥瓜蔞主要含有糖苷、萜類及有機酸類成分，在抗腦缺血、促進免疫作用方面發揮療效，可以顯著提高巨噬細胞活性，促進淋巴細胞轉化[16]；臣藥丹參，活血祛瘀，其有效成分丹參酮ⅡA可以減輕中性粒細胞在缺血腦組織的浸潤，減少炎性介質的釋放，改善腦缺血的炎癥反應[17]；方中葛根有效成分葛根素能抑制腦缺血再灌注模型炎癥細胞因子TNF-α、IL-6等的釋放，改善神經炎癥[18]。本研究結果表明，GMK能顯著延長小鼠斷頭后呼吸時間和呼吸次數，降低小鼠全腦IL-1β和PGE2含量。推測GMK所含的多種有效成分可以通過抑制IL-1β和PGE2的表達，減輕炎癥反應對腦缺血損傷的過程，起到改善急性腦缺血的作用。