耐多藥和廣泛耐藥MTB的inhA基因突變與對(duì)丙硫異煙胺耐藥的相關(guān)性分析

宋艷華 王桂榮 霍鳳敏 劉榮梅 高孟秋 李琦

結(jié)核病目前仍是危害人類健康的重大傳染病，耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的出現(xiàn)和流行是目前全球結(jié)核病控制的重大挑戰(zhàn)。世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，2016年全球約有MDR-TB新發(fā)患者60萬例，而在中國估計(jì)每年MDR-TB新發(fā)約7.3萬例[1]。2016年，“WHOtreatmentguidelinesfordrug-resistanttuberculosis”中推薦，在MDR-TB治療組成方案中至少需要包括4種有效的藥物[2]，但是由于耐藥、治療費(fèi)用及藥物不良反應(yīng)等原因，選擇有效的、能持續(xù)應(yīng)用的藥物組成方案較困難，特別是對(duì)于廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)。

異煙肼(INH)是治療結(jié)核病的核心藥物，其主要耐藥機(jī)制是katG和(或)inhA基因突變，katG突變可造成結(jié)核分枝桿菌(MTB)對(duì)高濃度INH耐藥，inhA突變菌株多為對(duì)低濃度INH耐藥[最低抑菌濃度(MIC)一般為0.2～1.0 mg/L]，inhA突變是二線抗結(jié)核藥物丙硫異煙胺(PTH)或乙硫異煙胺(ETH)的耐藥機(jī)制之一，并且是INH和ETH/PTH交叉耐藥的分子基礎(chǔ)[3]。已有研究證明了高劑量INH治療MDR-TB有效[4]。WHO推薦高劑量INH作為一種推薦藥物用于MDR-TB的治療[2]，主要推薦用于inhA突變導(dǎo)致的低濃度INH耐藥的結(jié)核病患者。為此，筆者選取MDR-TB和XDR-TB臨床分離株，分析其inhA突變情況與對(duì)PTH進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)結(jié)果間的關(guān)聯(lián)性，以說明大劑量INH及PTH在耐藥結(jié)核病治療中的臨床應(yīng)用價(jià)值，為臨床醫(yī)生選擇藥物提供借鑒。

資料和方法

1.研究對(duì)象：選取2016年2月至2017年2月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院確診的132例MDR-TB或XDR-TB患者作為研究對(duì)象。研究對(duì)象臨床分離株均培養(yǎng)陽性且鑒定為MTB，具有INH、利福平(RFP)、左氧氟沙星(Lfx)、阿米卡星(Am)、卷曲霉素(Cm)及PTH藥敏試驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)具有katG和inhA突變檢測(cè)結(jié)果。

2.細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)：按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》對(duì)標(biāo)本進(jìn)行處理，并在改良羅氏培養(yǎng)基(購自深圳銀科公司)上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性菌落采用分枝桿菌藥敏檢測(cè)試劑盒(購自深圳銀科公司)進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)。操作方法參考產(chǎn)品說明，臨界濃度分別為：INH 0.2 μg/ml、RFP 2 μg/ml、Lfx 2 μg/ml、Am 1 μg/ml、Cm 2.5 μg/ml、PTH 10 μg/ml，在這一濃度上生長(zhǎng)定義為耐藥。

3.基因突變檢測(cè)：痰液和膿液等臨床標(biāo)本先經(jīng)過N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉法(NALC-NAOH)去污處理；支氣管肺泡灌洗液及其培養(yǎng)物直接取樣加入提取液，經(jīng)加熱離心提取DNA，采用INH耐藥基因突變檢測(cè)試劑盒(購自廈門致善生物科技有限公司)進(jìn)行熒光定量PCR熔解曲線分析[5]，記錄katG和inhA基因突變結(jié)果。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用“率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.藥敏試驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果，132株臨床分離菌株中MDR-MTB有89株(67.4%)、前廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌(pre-XDR-MTB，即：在對(duì)INH和RFP耐藥的基礎(chǔ)上，同時(shí)對(duì)二線注射類藥物或氟喹諾酮類藥物中的一種藥物耐藥)有26株(19.7%)、XDR-MTB有17株(12.9%)。

2.耐藥基因突變情況：katG突變率(合并及不合并inhA突變)為73.5%(97/132)，在MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB中分別為69.7%(62/89)、73.1%(19/26)、94.1%(16/17)；inhA單突變率(不含katG突變)為 15.9%(21/132)，在MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB中分別為18.0%(16/89)、15.4%(4/26)、5.9%(1/17)。inhA+katG雙基因突變率在MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB中分別為1.1%(1/89)、7.7%(2/26)、11.8%(2/17)。

3.對(duì)PTH表型耐藥與inhA突變的關(guān)系：菌株對(duì)PTH的總耐藥率為22.7%(30/132)，在MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB中分別為11.2%(10/89)、30.8%(8/26)、70.6%(12/17)。XDR-MTB對(duì)PTH的耐藥率明顯高于MDR-MTB(χ2=30.57，P<0.01)和pre-XDR-MTB(χ2=6.55，P<0.05)。inhA突變率(合并及不合并katG突變)在MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB菌株中分別為19.1%(17/89)、23.1%(6/26)、17.6%(3/17)；inhA突變菌株對(duì)PTH表型耐藥率分別為29.4%(5/17)、4/6、3/3。在MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB的PTH耐藥株中，分別有5/10、4/8、3/12發(fā)生inhA基因突變。無katG和inhA突變的14株菌對(duì)PTH均敏感。92株無inhA突變(單katG突變)株對(duì)PTH耐藥情況有差異：MDR-MTB、pre-XDR-MTB和XDR-MTB菌株對(duì)PTH的耐藥率分別為8.2%(5/61)、23.5%(4/17)和64.3%(9/14)；XDR-MTB菌株對(duì)PTH的耐藥率明顯高于MDR-MTB和 pre-XDR-MTB菌株，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.05，P<0.01；Fisher精確概率法，P<0.05)。132株臨床分離株的表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果與耐藥基因突變的相關(guān)性見表1?？梢?，MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB菌株中，katG仍為主要突變基因，且從MDR-MTB到XDR-MTB突變率升高，而inhA單基因突變率降低。從MDR-MTB到XDR-MTB，對(duì)PTH耐藥率明顯增加，而菌株inhA突變率低于其對(duì)PTH表型耐藥率。

表1 132株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果與耐藥基因突變的相關(guān)性

討 論

MTB對(duì)INH的耐藥與許多基因突變相關(guān)，發(fā)生頻率最高的是katG編碼區(qū)和inhA突變，katG315突變最常見，有30%～94%耐藥株發(fā)生該突變[3，6]。inhA突變包括其啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)突變，占對(duì)INH耐藥MTB菌株的8%～43%[4]，絕大多數(shù)菌株以啟動(dòng)子區(qū)突變?yōu)橹鱗3]。katG和inhA在對(duì)INH耐藥MTB菌株中的突變率具有地域性差異。本次研究結(jié)果顯示，MDR-MTB、 pre-XDR-MTB和XDR-MTB中inhA單突變率是18.0%、15.4%、5.9%。據(jù)報(bào)道，不同地區(qū)對(duì)INH耐藥MTB菌株inhA突變率(合并及不合并katG突變)不同，埃塞俄比亞為0.8%[7]，波蘭為4%[8]，菲律賓為22%[9]，中國廈門為27.8%[5]。南非研究顯示，MDR-MTB和XDR-MTB菌株inhA單突變率分別為14.8%和10.3%[4]。MTB菌株inhA基因突變與其對(duì)INH低度耐藥和PTH高度耐藥相關(guān)[3]，inhA突變而katG未突變的MTB菌株感染者可能將受益于高劑量INH的治療。筆者本次研究結(jié)果和南非的數(shù)據(jù)都顯示，隨著耐藥種類的增多(從MDR-MTB到XDR-MTB)，inhA單突變菌株有減少趨勢(shì)，推測(cè)在XDR-TB患者常規(guī)藥物治療方案中加用高劑量INH可能受益小于MDR-TB患者[4]。

本次研究顯示，MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB菌株中inhA+katG雙基因突變率分別為1.1%、7.7%、11.8%，而南非地區(qū)研究顯示以上3種菌株中inhA+katG雙基因突變率分別為15%、43%、73%[4]，均高于本次研究結(jié)果。MTB菌株inhA基因突變是其INH、PTH/ETH交叉耐藥的分子基礎(chǔ)，南非地區(qū)研究顯示，XDR-MTB有較高的ETH耐藥，考慮為inhA突變所致[4]，inhA突變可作為預(yù)測(cè)MTB菌株對(duì)ETH耐藥及XDR-TB的分子標(biāo)識(shí)。本次研究顯示，從MDR-MTB到XDR-MTB，inhA突變株對(duì)PTH的耐藥率逐漸升高，但在MDR-MTB中仍有部分inhA突變菌株對(duì)PTH敏感。而且，在XDR-MTB中inhA(合并及不合并katG突變)突變率不高(17.6%)，但是對(duì)PTH耐藥率為70.6%，所以不同于非洲MTB菌株特征；故本次研究中，XDR-MTB菌株中inhA突變可能不是對(duì)PTH產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制。PTH與ETH作為前藥，需要單加氧酶EthA蛋白激活作為活性形式(ETH-NAD或PTH-NAD)作用于inhA而發(fā)揮生物效應(yīng)。inhA和ethA基因突變是MTB對(duì)ETH與PTH 耐藥的主要分子機(jī)制。Tan等[10]研究顯示，在46株對(duì)PTH耐藥的臨床分離株中，19株有ethA突變、22株有inhA(調(diào)控區(qū)或編碼區(qū))突變。Vilchèze和Jacobs[3]報(bào)道，MDR-MTB對(duì)ETH的耐藥菌株中有54.2%～100.0%具有ethA突變。ethA突變也可能是XDR-MTB菌株對(duì)PTH產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制。另外，Tan等[10]研究顯示，MTB對(duì)Lfx耐藥可能與對(duì)PTH耐藥相關(guān)(OR=2.18，95%CI：1.02～4.63；P=0.04)，認(rèn)為可能是MTB菌株暴露于氟喹諾酮而引起的氧自由基產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)其發(fā)生對(duì)PTH耐藥相關(guān)基因的突變。因此，未檢測(cè)到inhA突變的菌株并不一定對(duì)PTH敏感，尤其在XDR-MTB中即使不存在inhA突變，常規(guī)給患者加用PTH可能無效。

本研究仍存在一定的局限和不足之處。首先，本研究是臨床數(shù)據(jù)的總結(jié)，實(shí)驗(yàn)室只是報(bào)告有無katG突變和inhA突變，沒有具體突變位點(diǎn)的描述，所以沒能對(duì)katG和inhA突變位點(diǎn)及inhA基因調(diào)控區(qū)或編碼區(qū)突變具體描述。熔解曲線法試劑盒是對(duì)INH耐藥檢測(cè)位點(diǎn)包括inhA94、inhA啟動(dòng)子區(qū)-17～-8位點(diǎn)突變、katG315密碼子檢測(cè)，研究數(shù)據(jù)katG315突變均和INH高度耐藥相關(guān)，inhA突變以啟動(dòng)子區(qū)突變?yōu)橹?，并且這一啟動(dòng)子和編碼區(qū)突變均可導(dǎo)致對(duì)INH的低度耐藥[3]，并且均與對(duì)PTH的耐藥相關(guān)。所以，雖然沒有對(duì)具體位點(diǎn)進(jìn)行描述，但是不影響檢測(cè)結(jié)果臨床意義的判斷。第二，研究對(duì)象數(shù)量有限，且均來自筆者醫(yī)院，而筆者所在醫(yī)院多收治以北方為主的、全國的難治性結(jié)核病患者，就診患者中耐藥患者較多，所以數(shù)據(jù)結(jié)果可能有偏倚。

綜上所述，本次研究結(jié)果顯示MDR-MTB和XDR-MTB菌株對(duì)INH耐藥相關(guān)的基因突變均是以katG突變?yōu)橹鳎粡腗DR-MTB到XDR-MTB，inhA單突變率降低。所以，在XDR-TB中常規(guī)治療方案加用高劑量INH可能使患者受益很小。從MDR-MTB到 XDR-MTB菌株中，對(duì)PTH耐藥率明顯增加，inhA基因突變率下降，未檢測(cè)到inhA突變的菌株并不一定對(duì)PTH敏感，尤其是在XDR-MTB中，inhA突變可能不是菌株對(duì)PTH耐藥的主要原因，建議完善其他分子檢測(cè)或者藥敏試驗(yàn)，制定個(gè)體化的治療方案。