Th17/Treg、IL-17在慢性阻塞性肺疾病患者中的表達及與肺功能的相關性

張占強，吳春艷，方 彬，王美玲，牛慧艷

(1. 河北省涿州市醫院，河北 涿州 072750；2. 河北省保定市第一中心醫院，河北 保定 071000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是臨床上常見的呼吸系統疾病，近年來其發病率呈持續增長的趨勢[1]。COPD的病理基礎是氣道壁和肺實質的慢性炎癥及結構破壞，可表現為肺實質改變及外周血T淋巴細胞數量異常[2]。研究表明，輔助性T細胞17(Th17)及調節性T細胞(Treg)參與各種自身免疫性疾病和慢性感染性疾病中的免疫調節，在COPD發病機制中發揮著重要作用[3-4]。而白細胞介素-17(IL-17)是Th17細胞特異性分泌的細胞因子，可誘導機體組織損傷，并參與炎癥反應的發生發展[5]。本研究通過觀察慢性阻塞性肺疾病患者外周血淋巴細胞中Th17和Treg細胞含量及IL-17水平變化，并分析Th17、Treg及IL-17與肺功能指標的相關性，探討Th17、Treg及IL-17在COPD患者預后評估中的價值，以期為臨床防治提供依據。

1 臨床資料

1.1一般資料 選取2014年1月—2016年10月河北省涿州市醫院呼吸內科收治的COPD患者共184例作為COPD組，其中男118例，女66例，年齡36～81(63.28±10.16)歲。COPD穩定期患者92例，COPD急性加重期(AECOPD)患者92例。COPD的診斷均符合中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組修訂的《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》[6]。排除合并有其他肺部疾病或感染者，合并有其他系統疾病如心、肝、腦、腎等嚴重功能障礙者，長期應用激素者，惡性腫瘤或預計生存期不到3個月者，近期手術、妊娠及哺乳期者。另選取同期我院健康體檢者95例作為對照組，男60例，女35例，年齡38～79(62.54±9.83)歲。各組性別、年齡及病史等基本資料比較差異無統計學意義(P均>0.05)，均具有可比性。

1.2主要儀器及試劑 美國Becton Dickinson公司的FACS Calibur流式細胞儀，流式抗體均購自美國Becton Dickinson公司。細胞刺激培養所需離子霉素、豆蔻酰佛波醇乙酯、莫能菌素購自美國ENZO Alexis-Biomol公司，胞內檢測所需固定破膜試劑盒及熒光定量PCR所需試劑購自美國Invitrogen公司，所需引物、探針由上海博亞生物技術公司合成。熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司(ABI 7500 Sequence Detection System)，酶標儀購自美國Bio-Rad公司(型號550)，低溫高速離心機(Beckman)。ELISA試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3研究方法 比較各組外周血Th17、Treg、Th17/Treg、IL-17水平及肺功能指標情況，分析Th17、Treg、Th17/Treg、IL-17與肺功能指標的相關性，并應用ROC曲線評價Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17對AECOPD患者的診斷效能。

1.3.1外周血Th17及Treg細胞檢測 所有研究對象均于清晨空腹采集靜脈血3 mL，經肝素抗凝及加入等體積淋巴細胞分離液后1 500 r/min離心15 min，得到外周血單個核細胞(PBMC)懸液，鋪至24孔細胞培養板，并在RPMI-1640培養基中加入10%胎牛血清。每孔加入豆蔻酰佛波醇乙酯2.5 μL(終濃度50 ng/mL)、離子霉素2 μL(終濃度1 μg/mL)及莫能菌素2 μL(終濃度10 μg/mL)吹打混勻，孵育4 h。加入抗人CD4單抗20 μL，室溫避光孵育20 min。再通過加入染色緩沖液2 mL及抗IL-17單抗20 μL，室溫孵育15 min，此后1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入染色固定液1 mL，等待上流式細胞儀檢測。

1.3.2肺功能檢查 采用肺功能儀(Sensormedics)對所有研究對象行肺功能檢查，包括測定第1秒用力呼氣量(FEV1)、FEV1占預計值百分比(FEV1%)、用力肺活量(FVC)、FVC占預計值百分比(FVC%)及第1秒用力呼氣量占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC)。目前臨床上以FEV1作為COPD診斷、分級和衡量預后的標準。

2 結 果

2.1COPD組與對照組外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17水平比較 COPD組外周血Th17、Th17/Treg及IL-17水平均明顯高于對照組(P均<0.05),外周血Treg細胞含量明顯低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 2組外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17水平比較

2.2各組外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17水平比較 AECOPD組和COPD穩定期組外周血Th17、Th17/Treg及IL-17水平明顯高于對照組(P均<0.05)，且AECOPD組外周血Th17、Th17/Treg及IL-17水平明顯高于COPD穩定期組(P均<0.05)。AECOPD組和COPD穩定期組外周血Treg細胞含量均明顯低于對照組(P均<0.05)，且AECOPD組外周血Treg細胞含量明顯低于COPD穩定期組(P<0.05)。見表2。

2.3各組肺功能指標比較 AECOPD組和COPD穩定期組FEV1、FEV1%、FVC、FVC%、FEV1/FVC均明顯低于對照組(P均<0.05)；且AECOPD組FEV1、FEV1%、FVC%、FEV1/FVC均明顯低于COPD穩定期組(P均<0.05)。見表3。

表2 各組外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17水平比較

表3 各組肺功能指標比較

2.4外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17與肺功能指標的相關性分析 Spearman相關性分析顯示，COPD患者外周血Th17、Th17/Treg及IL-17與FEV1、FEV1%、FVC、FVC%、FEV1/FVC均呈負相關(P均<0.05)；而COPD患者外周血Treg細胞與FEV1、FEV1%、FVC、FVC%、FEV1/FVC均呈正相關(P均<0.05)。其中外周血Th17、IL-17與FEV1%的相關性較好(r=-0.747，-0.753，P<0.05)。見表4和圖1。

2.5外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17對AECOPD的診斷價值 外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17診斷AECOPD的AUC及95%CI分別為0.862[0.764，0.963]，0.783[0.705，0.848]，0.814[0.726，0.875]，0.851[0.758，0.946]與對照組(AUC=0.5)比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。取外周血Th17最佳臨界值為7.28%時，其診斷AECOPD的靈敏度和特異度最好，分別為80.4%和87.3%。見圖2和表5。

表4 外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17與肺功能指標的相關性分析

表5 外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17對AECOPD的診斷價值

圖1 外周血Th17、IL-17與FEV1%的相關性

圖2 外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17診斷AECOPD的ROC曲線

3 討 論

COPD是各種炎癥細胞參與的全身異常炎癥反應性疾病，以不完全可逆的氣流受限為主要特征。目前，COPD的發病率較高，預后較差，嚴重危害人類健康，同時給患者及社會帶來沉重的經濟負擔。因此，如何早期診斷及預測其病情嚴重程度對降低COPD的病死率具有重要意義。

Th17與Treg是一類近年來發現的淋巴細胞亞群，兩者分化上相互關聯，功能上相互拮抗，Th17/Treg細胞的平衡關系對于維持機體免疫穩定和預防炎癥性疾病的發生具有重要作用[7-8]。Th17細胞分泌的IL-17可促使體內炎癥細胞釋放大量的致炎因子和趨化因子，誘導和活化中性粒細胞，進而引起中性粒細胞向炎癥組織聚集[9]。多項研究表明，Th17/Treg可能在慢性炎癥性肺部疾病發生和發展過程中發揮著重要的調節作用[10-11]。本研究結果顯示，COPD組外周血Th17、Th17/Treg及IL-17水平明顯高于對照組，而COPD組外周血Treg細胞含量明顯低于對照組，與Li等[12]研究結果基本一致。這提示Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17可能參與COPD的發生發展。Chang等[13]研究表明，在COPD患者中CD8+和CD4+細胞所產生的細胞因子IL-17A和IL-17F相對于對照組是明顯增加的。COPD是慢性炎癥反應，且炎癥主要從肺部產出，引起全身炎癥反應，進而引起組織破壞的病理性免疫應答發生，使Treg細胞含量減少。與對照組比較，COPD穩定期組外周血Th17、Th17/Treg及IL-17水平明顯升高，且AECOPD組升高更明顯；與對照組比較，COPD穩定期組外周血Treg細胞含量明顯下降，且AECOPD組下降更明顯。可見Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17在COPD的發病過程中起著重要的作用，與COPD癥狀嚴重程度密切相關。Domagaa-Kulawik等[14]研究認為，Th17/Treg平衡參與了COPD的免疫調節過程，使得Th17及Treg細胞含量在COPD患者不同時期中存在差異。另有研究也表明，IL-17作為致炎因子，全程參與了COPD患者炎癥的發生、發展，隨著COPD病變程度的加重，IL-17水平隨之升高，Th17細胞及其特異性分泌因子IL-17可能介導了COPD的炎癥過程[15-16]。與對照組比較，COPD穩定期組FEV1、FEV1%、FVC%、FEV1/FVC明顯下降，且AECOPD組下降更明顯。相關性分析顯示，COPD患者外周血Th17、Th17/Treg及IL-17水平隨FEV1、FEV1%、FVC、FVC%、FEV1/FVC的下降而明顯升高；COPD患者外周血Treg細胞含量隨FEV1、FEV1%、FVC、FVC%、FEV1/FVC的下降而明顯下降。這說明自身免疫功能失調對COPD患者肺功能的下降產生重要的影響，Th17型免疫應答介導了COPD發病過程中的自身免疫應答，同時由于COPD患者體內具有免疫抑制作用的Treg細胞數下降或功能異常可引起患者肺功能指標下降。既往研究發現，自身免疫反應是導致COPD患者持續存在氣道慢性炎癥的主要原因，而持續存在氣道慢性炎癥可導致上皮細胞損傷甚至氣道重塑，最終導致肺功能損傷[17-18]。此外，IL-17參與了COPD患者肺部慢性炎癥進展的病理損傷，IL-17水平與COPD氣道受限加重程度呈正相關[19]。應用ROC曲線分析顯示，外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17對AECOPD的診斷具有重要的參考價值，而且外周血Th17最佳臨界值為7.28%時，其診斷AECOPD的靈敏度和特異度最好，分別為80.4%和87.3%。說明外周血Th17細胞水平可有效地反映COPD患者病情嚴重程度，是預測COPD急性加重的可靠指標。Podolin等[20]研究也表明，外周血Th17細胞水平較傳統感染標志物(CRP、WBC)更能準確地預測感染和炎癥水平，是早期預測AECOPD的有效指標。因此，通過抑制COPD患者外周血Th17細胞水平，可顯著降低患者機體炎癥反應，從而改善患者預后。

綜上所述，外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17參與了COPD患者呼吸道慢性炎癥的發生發展過程，并可能導致炎癥的持續存在及肺功能的逐步損害，同時與COPD病情嚴重程度密切相關。但本研究為小樣本單中心研究，可能存在一定的偏倚，尚需多中心、大規模的前瞻性研究來進一步證實。