子癇前期患者血清及胎盤組織中VEGF和MMP-9的研究

王 書，張久梅

（1.白銀市白銀區人口和計劃生育服務站，甘肅 白銀 730900；2.深圳市第二人民醫院，廣東 深圳 518000）

子癇前期或稱為先兆子癇，是妊娠期的特發性疾病，在我國的發病率為5%～8%[1]。其發病原因主要可能涉及以下幾個方面[2]：血管內皮損傷、滋養細胞侵襲異常、免疫調節功能異常、遺傳因素、營養因素等。血管內皮生長因子（VEGF）是一種肝素結合生長因子，對血管內皮細胞具有特異性，能夠誘導新血管生長[3]。血液中的VEGF與其受體結合，能夠激活細胞內的酪氨酸激酶，繼而使下游細胞信號級聯啟動，從而促使新血管生長[4]，它對著床、胎盤血管形成有重要意義。基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）是一類肽鏈內切酶，又稱明膠酶，主要由滋養細胞、內皮細胞以及結締組織細胞和某些腫瘤細胞分泌[5]，其主要功能是保持細胞外基質的動態平衡。鑒于上述二者如此重要的生理功能，本研究著力于分析其在孕婦胎盤組織中的表達，揭示二者與子癇前期發生的關系，造福患者。

1 材料

1.1 受試對象

選擇2013年1月至2014年12月在蘭州大學第一醫院進行剖宮產術分娩的子癇前期孕婦81例，其中輕度子癇前期41例（定義為輕度組），重度子癇前期40例（定義為重度組），另外選擇相同時期孕足月進行剖宮產術分娩的45例健康孕婦為對照組。按照全國統編教材《婦產科學》第7版分類和診斷標準[6]進行分類。3組孕婦均為單胎，胎兒無畸形；孕婦既往均無嚴重病史、不良孕產史以及長期服用藥物史，各組孕婦都排除內科合并癥以及產科并發癥。

1.2 主要試劑及來源

VEGF酶聯免疫法試劑盒購自上海卡努生物科技有限公司；MMP-9酶聯免疫法試劑盒購自廈門慧嘉生物科技有限公司；免疫組化（SP法）染色試劑盒、鼠抗人VEGF單克隆抗體、山羊抗人MMP-9多克隆抗體均采購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

2 方法

2.1 血清樣本的采集

采集孕婦分娩前清晨靜脈血，離心機2 000 r/min離心15分鐘，收集血清，于4℃保存，用于檢測，樣本在收集12小時之內進行實驗。

2.2 胎盤樣本的收集

剖宮產過程中孕婦胎盤娩出以后，在臍帶附著處取組織一塊（母體面），面積約1 cm×1 cm×1 cm，無出血鈣化，用pH為7.0的無菌PBS沖洗干凈，然后放置在4%的福爾馬林中，固定24小時以上，然后用石蠟包埋，制成4 μm連續切片。所有樣本的獲得均取得受試對象與親屬的知情同意。

2.3 血清VEGF、MMP-9的檢測

采用VEGF、MMP-9酶聯免疫法試劑盒進行檢測，具體操作方法參照試劑盒說明書進行。

2.4 免疫組化測定方法

免疫組化的具體步驟[7]參照《病理學技術》及金橋生物SP法試劑盒說明書進行。

2.5 實驗室結果判定

在高倍顯微鏡下（400倍）觀察石蠟切片中細胞免疫染色情況，VEGF、MMP-9陽性判定標準為顯微鏡下細胞核或細胞漿內出現棕黃色細顆粒，對每張切片隨機選擇3個視野，200個/視野。判斷標準參照Birner法[8]。根據陽性細胞染色的強度和細胞顯色的比例進行半定量判定。按染色強度評分：染色無0分；染色弱1分；中等染色2分；強染色3分。按陽性細胞百分比評分：陽性細胞數＜10%得1分；陽性細胞數11%～50%得2分；陽性細胞數51%～80%得3分；陽性細胞數＞80%得4分。兩種評分結果相加分為 4個等級：陰性（-）：0～1分；弱陽性（+）：2～3分；中陽性（＋＋）：4～5 分；強陽性（＋＋＋）：6～7 分。

3 數據處理

數據用SPSS 20.0統計軟件進行處理分析。計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料采用kruskal-wallis H檢驗、Mann-whitney檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析。以α=0.05作為檢驗水準，采用origin Pro 8.0作圖。

4 結果

4.1 一般資料比較

3組孕婦在年齡、孕周之間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表 1。

4.2 3組血清樣本中VEGF、MMP-9的檢測

表 1 3 組孕婦年齡、孕周比較（x±s）

3組血清樣本中VEGF與MMP-9的含量見圖1。結果顯示：與對照組相比，輕度組與重度組的血清VEGF含量顯著性降低（P＜0.05），但輕度組與重度組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與對照組相比，輕度組與重度組的血清MMP-9含量顯著性降低（P＜0.05），重度組較輕度組的MMP-9含量顯著降低（P＜0.05）。

圖13組血清樣本中VEGF、MMP-9的含量

4.3 3組胎盤樣本中VEGF的表達

3組孕婦胎盤樣本中均有VEGF陽性表達，細胞膜和細胞漿是主要表達部位，此外，還有少量的VEGF在絨毛間質中表達，陽性表達染色呈深黃色或黃褐色（見圖2）。VEGF在3組胎盤樣本中表達強度的比較見表2。表2顯示，對照組VEGF陽性表達率95.56%，輕度組VEGF陽性表達率73.17%，重度組VEGF陽性表達率37.50%。輕度組與對照組的VEGF陽性表達率比較，差異有統計學意義（Z=-6.775，P＜0.05），重度組與對照組的VEGF陽性表達率比較，差異有統計學意義（Z=-2.294，P＜0.05），重度組與輕度組的VEGF陽性表達率比較，差異有統計學意義（Z=-2.291，P＜0.05）。

圖2 3組胎盤樣本中VEGF免疫組化結果

表2 3組胎盤樣本中VEGF的表達

4.4 3組胎盤樣本中MMP-9的表達

3組孕婦胎盤樣本中均有MMP-9陽性表達，輕度組、重度組樣本中MMP-9定位與對照組相同，絨毛滋養細胞是主要表達部位，陽性染色都呈現棕色、褐色（見圖3）。MMP-9在3組胎盤樣本中表達強度的比較見表3。表3顯示，對照組MMP-9陽性表達率86.67%，輕度組MMP-9陽性表達率65.85%，重度組MMP-9陽性表達率37.50%。輕度組與對照組MMP-9陽性表達率比較，差異有統計學意義（Z=-1.984，P＜0.05），重度組與對照組MMP-9陽性表達率比較，差異有統計學意義（Z=-2.844，P＜0.05），重度組與輕度組MMP-9陽性表達率比較，差異有統計學意義（Z=-2.437，P＜0.05）。

圖3 3組胎盤樣本中MMP-9免疫組化結果

表3 3組胎盤樣本中MMP-9的表達

4.5 樣本中VEGF與MMP-9的相關性研究

調查結果顯示：血清VEGF含量與胎盤VEGF表達的相關系數0.897，兩者呈正相關（P＜0.05）；血清MMP-9含量與胎盤MMP-9表達的相關系數1.000，兩者呈正相關（P＜0.05）；血清VEGF含量與血清MMP-9含量的相關系數0.922，兩者呈正相關（P＜0.05）；胎盤VEGF表達與胎盤MMP-9表達的相關系數0.999，兩者呈正相關（P＜0.05），具有見表 4。

表4VEGF與MMP-9的相關性

5 討論

5.1 血清、胎盤樣本中VEGF與子癇前期的關系

VEGF是一種功能強大且能產生多種效應的細胞因子[9]，它具有誘導血管生成、提高血管的滲透性、改善血流動力學功能等重要作用。本研究從血清學、組織學、細胞學的角度研究VEGF的表達與子癇前期的關系。分析以上的數據結果可以看出，子癇前期孕婦血清中的VEGF含量顯著降低，胎盤組織中VEGF的表達也顯著降低，并且隨著病情的加重，VEGF的表達降低越多。由此推測VEGF的低表達可能引起子癇前期的發生。在妊娠前期由于VEGF合成和釋放減少，影響滋養細胞的增殖與分化，影響了胎盤血管的形成，最終造成子癇前期疾病的發生。另外血清VEGF含量與胎盤VEGF的表達呈現正相關（P＜0.01），由此提示在臨床應用中可以通過檢測孕婦血清中的VEGF含量來預防子癇前期發生的風險。目前，SFDA已經有批準文號的血清VEGF試劑盒（如威海威高VEGF試劑盒）應用于臨床診斷，但是實際應用主要針對腫瘤的檢測，依然沒有合理的參考水平范圍來定義子癇前期的發病，未來隨著研究的深入，相信這個問題會得到解決。

5.2 血清、胎盤樣本中MMP-9與子癇前期的關系

MMP-9的生理作用廣泛，主要功能是保持細胞外基質的動態平衡，例如胚胎發育、繁殖、血管和骨骼發育、傷口愈合、細胞遷移、學習、記憶以及在病理過程中的分解，如關節炎、腦出血以及癌細胞擴散等。MMP-9可能在新血管形成中發揮重要作用，有顯著的證據[10]表明，MMP-9對血管生成的重要組分內皮干細胞的形成有重要作用。基于以上研究數據顯示，與正常孕婦相比，子癇前期孕婦血清中的MMP-9顯著降低，胎盤組織中的MMP-9的表達也顯著降低，并且隨著病情的加重，MMP-9的降低更加明顯。由此推測：胎盤組織MMP-9的表達降低可能也是子癇前期發病機制中的相關因素。在妊娠期，MMP-9的低表達使細胞外基質降解與重塑功能減弱，使血管內皮干細胞生成緩慢，進而影響滋養細胞的增殖與分化、血管的形成，最終造成子癇前期的發生。另外血清MMP-9含量與胎盤MMP-9的表達呈現正相關（P＜0.05），提示在臨床應用中可以通過檢測孕婦血清中的MMP-9含量來預防子癇前期發生的風險。目前血清MMP-9檢測試劑盒均為科研用途，依然沒有應用于臨床診斷的MMP-9試劑盒。

5.3 VEGF與MMP-9的關系

本研究結果顯示，無論是血清中VEGF與MMP-9的含量，還是胎盤組織中VEGF與MMP-9的表達，均存在正相關關系（P＜0.05），這與黃建超[11]的研究MMP-9可通過釋放血管內皮生長因子（VEGF）以參與血管生成具有一致性。

綜上所述，基于VEGF、MMP-9血清學的檢測以及在胎盤組織中的定位表達，說明二者均參與了正常妊娠生理過程，二者的低表達可能引起孕婦子癇前期的發生。