白及GMP基因cDNA全長克隆及生物信息學分析

許 娟，石云平，韋紹龍，蘇祖祥，林 茜，桂 杰，胡一鳳，李小泉*

(1. 廣西農業科學院生物技術研究所，廣西 南寧 530007；2. 廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.為蘭科多年生草本植物，具有上千年藥用歷史，在本草經集注、本草圖經及本草綱目中都有記載[1-2]。白及以塊莖(假鱗莖)入藥，塊莖組織中含40 %～50 %天然水溶性多糖。目前已從白及中分離出20多種糖苷類化合物，其中白及多糖是報道最多的化合物，也是目前最有開發前景的藥物。白及多糖具有促進人類臍靜脈內皮細胞生長及血管內皮細胞生長因子的表達[3]、緩和炎癥反應[4]等功能。近期有臨床研究報道白及膠可作為外源性重組人表皮生長因子載體，能促進創面表皮細胞DNA合成，加速傷口愈合等[5]。因此，研究白及多糖合成的分子機制對培育富含多糖的白及新品種具有重要意義。【前人研究進展】白及多糖以甘露聚糖家族的葡萄甘露聚糖為主，GDP-甘露糖的合成是白及多糖合成的第一步，GDP-甘露糖由GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GMPase)催化甘露糖-1-磷酸而成，GMPase是甘露聚糖合成的關鍵酶[6]。1956年，Munch-Petersen[7]首次從brewer酵母中分離到一種可以催化甘露糖-1-磷酸和GTP生成GDP-甘露糖的酶，1964年其正式被命名為GDP-甘露糖焦磷酸化酶。1996年，酵母中的GMP基因首次被克隆到[8]，隨后，其它植物中的GMP基因也被克隆出來，如擬南芥[9]、馬鈴薯[10]、番木瓜[11]、水稻[12]和番茄[13]等。何春梅[14]克隆了2個鐵皮石斛GMP，分別命名為DoGMP1和DoGMP2，DoGMP1的cDNA全長為1528 bp，開放性閱讀框(ORF)1086 bp，編碼362個氨基酸的蛋白；DoGMP2的cDNA全長為1492 bp，開放性閱讀框(ORF)1248 bp，編碼416個氨基酸的蛋白。【本研究切入點】目前有關白及多糖合成的研究較少，白及GMP基因的克隆也未見報道，白及GMP基因的序列及結構等分子生物學特性尚不明確。【擬解決的關鍵問題】以白及葉片為材料，通過同源基因比對，設計兼并引物，利用RACE-PCR方法從白及中克隆GMP基因的cDNA全長，并進行生物信息學分析，為該基因在白及中的功能研究奠定基礎，為培育富含多糖的白及新品種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗材料 采用“桂及1號”白及為試驗品種，采取廣西農業科學院生物技術研究所種植基地生長1年以上植株的新鮮葉片，用水清洗處理并擦干，迅速放入液氮中速凍，并裝袋于-80 ℃超低溫冰箱中貯存備用。

1.1.2 主要試劑 RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；pMD19-T載體、dCTP和M-MLV逆轉錄酶，購自TaKaRa公司；dNTP、TaqDNA聚合酶和氨芐青霉素(Amp)，購自上海生工生物工程有限公司；SMARTerTMRACE擴增試劑盒，購自Clontech公司；目的條帶膠回收試劑盒，購自QIAGEN 公司；Tris-HCl、EDTA、瓊脂糖等試劑為市銷售進口或國產分析純。引物合成及DNA測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.1.3 引物設計 采用Primer 5和Oligo 6.0設計基因克隆所用引物。具體引物序列見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA合成 用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，并利用NANODROP 1000核酸蛋白檢測儀測定其濃度和純度。參照逆轉錄酶M-MLV說明書合成cDNA，引物為Oligo(dT)18。

1.2.2 白及GMP基因中間片段的PCR擴增 根據NCBI已登錄的其它植物GMP基因序列的保守區設計簡并引物GMP-F和GMP-R(表1)。PCR擴增反應總體系為25 μl：cDNA模板1 μl，dNTP(10 mmol/L)0.5 μl，GMP-F，GMP-R(10 mmol/L)各0.5 μl，Taq酶0.2 μl，緩沖液2.5 μl，雙蒸水19.8 μl。擴增程序：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min，36個循環；72 ℃，8 min。取5 μl PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物序列

1.2.3 中間片段回收、測序 將PCR產物用QIAGEN PCR純化試劑盒回收，與pMD19-T載體連接，轉化大腸桿菌感受態DH5α，涂在含有100 μg/mL Amp的LB固體培養基上，37 ℃倒置培養過夜，挑取單菌落，在含Amp的液體LB培養基上37 ℃搖菌4 h，經菌液PCR檢測，將陽性克隆送上海生工公司測序。

1.2.4 白及GMP基因5′與3′末端RACE擴增 根據獲得的白及GMP基因的中間序列，分別設計5′端和3′端特異性巢式PCR引物GMP-5′1R、2R和和3′端特異性巢式PCR引物GMP-3′1F、2F(表1)，以白及葉片cDNA為模板，經2輪巢式PCR擴增，分別擴增GMP基因的5′端和3′端序列，具體按照Clontech公司SMARTerTMRACE擴增試劑盒說明書進行，將目的片段進行回收、連接、轉化和鑒定后，送陽性克隆到上海生工進行測序。

1.2.5 白及GMP基因cDNA全長的獲得 根據中間片段、5′與3′末端的測序結果，用Vector-NTI對序列進行比對和拼接，最后得到cDNA全長，并設計引物GMP-F′和GMP-R′(表1)擴增其全長序列，并測序進行驗證。

1.3 白及GDP-甘露糖焦磷酸化酶同源基因生物信息學分析

用Premier 5和Oligo 6.0軟件進行引物設計，用DNAmanV6軟件進行序列拼接和序列分析。利用ORF Finder在線工具對獲得的cDNA序列進行開放閱讀框(ORF)查找分析；用BLAST在線工具(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/Blast．cgi/)搜索GenBank的同源序列；用BioXM 2.6對氨基酸序列進行預測；用TMpred分析該基因編碼氨基酸組成、理論分子量和等電點等理化性質；通過Softberry服務器分析白及GDP-甘露糖焦磷酸化酶蛋白的亞細胞定位；運用NCBI的Conserved Domain Database(CDD)在線工具進行功能結構域分析；使用SWISS-MODEL在線工具預測蛋白質的三維結構；利用MEGA 5.0軟件構建進化樹。

1～2: 提取RNA樣品1-2: Extracted RNA samples圖1 白及“桂及1號”葉片總RNA瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from Bletilla striata leaves

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取及檢測

以生長1年以上“桂及1號”白及植株的新鮮葉片為材料，進行葉片總RNA提取，經1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，可見28S rRNA和18S rRNA條帶明亮清晰，說明所提取的RNA完整性較好。經NANODROP 1000核酸蛋白檢測儀測得OD260/OD280為2.05，OD260/OD230為1.84，表明RNA純度較高，可以用于RT-PCR擴增實驗。

2.2 白及GMP基因全長的克隆

以白及葉片總RNA反轉錄所得到的cDNA為模板，進行PCR擴增。擴增產物經凝膠電泳檢測發現約870 bp的條帶(圖2)，與預期片斷的大小一致，目的基因片段經過連接、轉化及菌液PCR鑒定，得到陽性克隆(圖3)，經測序，目的基因大小為873 bp，經BLAST比對分析，發現該序列與鐵皮石斛、蝴蝶蘭的GMP基因同源性很高。根據獲得的白及GMP基因中間片段的序列，分別設計5′端和3′端特異性巢式PCR引物，以cDNA為模板，經2輪巢式PCR擴增3′端和5′端基因序列，得到3′端基因序列長度為683 bp的片段和5′端基因序列長度為483 bp的片段(圖4)，將其與中間片段序列進行拼接，得到1523 bp的cDNA全長，對其進行擴增(圖5)，所得條帶與預期片段大小一致，測序結果表明拼接無誤。將本試驗獲得的白及GMP基因命名為BsGMP。

M: DL2000DNA marker; 1：擴增產物M: DL2000 DNA marker; 1: The fragment of RT-PCR圖2 白及GMP基因中間片段擴增結果Fig.2 Amplification results of partial GMP gene of Bletilla striata

M: DL2000 DNA marker; 1～8：陽性克隆M: DL2000 DNA marker; 1-8: Positive clones圖3 菌液PCR結果Fig.3 PCR results of bacteria solution

M: DL2000 DNA marker; 1：3′ 端序列擴增產物；2：5′ 端序列擴增產物M: DL2000 DNA marker; 1: Amplification products of 3′ RACE; 2: Amplification products of 5′ RACE圖4 白及GMP基因兩端部分序列擴增結果Fig.4 Amplification results of two ends of GMP gene

2.3 BsGMP同源基因的生物信息學分析

在NCBI的ORF finder軟件上查找BsGMP的編碼區，發現該基因的ORF為1086 bp，該基因所編碼的蛋白含有361個氨基酸(圖6)，分子量為39.35 kDa，等電點為6.03，含量最大的3種氨基酸為：Val(11.9 %)、Leu(9.7 %)和Gly(9.1 %)；亞細胞定位分析表明，BsGMP編碼的蛋白定位于細胞質，在線粒體中也有分布。Tmpred分析顯示該蛋白有2個可能的內部到外部跨膜螺旋區和2個可能的外部到內部跨膜螺旋區。利用NCBI的CDD在線工具進行BsGMP蛋白功能保守結構域分析，結果表明該蛋白含有醛酮還原酶的保守結構域(第1～24個氨基酸)和LbetaH家族保守區(第256～335個氨基酸)(圖7)。

將氨基酸序列導入SWISS-MODEL在線分析軟件中進行比對建模，用RasMol 2.7.5軟件對BsGMP蛋白的三級結構進行顯示(圖8)，可以看出，BsGMP蛋白具有11個典型的α螺旋，33個β折疊，同時具有46個β轉角。其中α螺旋用深紅色表示，β折疊用黃色表示，轉角用淡藍色表示，其他殘基用白色表示。

M: DL2000 DNA marker; 1：基因全長序列M: DL2000 DNA marker; 1: Gene full-length sequence圖5 白及GMP基因cDNA全長序列擴增(1523 bp)Fig.5 Amplification results of Bletilla striata GMP gene full-length(1523 bp)

2.4 BsGMP進化分析

將BsGMP序列與NCBI上其他物種的GMP基因序列進行比較，發現相似系數為64.0 %～95.0 %，其中與鐵皮石斛和蝴蝶蘭的相似系數最高達95.0 %。用MEGA 5.0軟件對不同物種GMP基因編碼的氨基酸序列構建進化樹(圖9)，發現BsGMP與已報道的鐵皮石斛和蝴蝶蘭同源性最近，因而最先聚在一起，草莓、甜櫻桃、金絲棗、核桃、胡楊和馬鈴薯也聚為一類，紫花苜蓿和擬南芥則被單獨聚為一類，說明BsGMP基因與擬南芥親緣性最遠，與蘭科植物GMP基因的親緣性較近。

3 討 論

GMP基因具有較高的保守性，GMPase催化所得產物 GDP-甘露糖，參與植物體內多種代謝途徑，如蛋白質糖基化作用、抗壞血酸、細胞壁和甘露聚糖的合成等。研究結果表明GMP與植物的逆境脅迫響應有關：李超漢等[15]發現番茄GMPase基因在馬鈴薯中的超表達，可使馬鈴薯抵御溫度脅迫能力明顯提高；張琳[16]對番茄中GMPase基因進行功能分析，轉正義T1代植株，GMPase酶活性和光合性能明顯增加，果實中可溶性糖的含量和糖酸比顯著增加，有機酸的含量顯著降低；Wang等[17]研究發現轉基因煙草GMP低水平表達時，對高溫或低溫更敏感；何春梅[14]對DoGMP1進行功能驗證，發現DoGMP1在擬南芥中的過表達不僅可以提高擬南芥的抗壞血酸含量和多糖含量，還可以提高其種子在鹽脅迫下的萌發率和植株對鹽脅迫的耐受性。國內外關于GMPase基因的研究還不多，只在少數作物如擬南芥[9]、馬鈴薯[10]、番木瓜[11]和水稻[12]等中克隆到了GMPase基因。Zou等[18]從番茄中克隆了GMPase基因的cDNA全長，共1535 bp，包含1086 bp的ORF，編碼361個氨基酸殘基，該基因推導的氨基酸序列經BLAST比對發現，其與馬鈴薯GMPase基因的同源性最高，達99 %，與煙草、紫花苜蓿和擬南芥的GMPase基因的同源性分別為97 %、91 %和89 %。本試驗利用RACE方法，首次從白及中克隆到一個GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因(BsGMP)，其cDNA全長1523 bp，其中包含1086 bp的完整ORF，編碼361個氨基酸的多肽，理論蛋白分子量為39.05 kDa，等電點為6.03，呈酸性。BLAST比對結果表明BsGMP氨基酸序列與其他物種氨基酸序列相似性為64.0 %～95.0 %，氨基酸同源性數據分析結果表明BsGMP基因分化后在不同物種內仍執行著相近的功能，與鐵皮石斛、蝴蝶蘭序列的相似性最高，達90.0 %以上，并聚為一支，說明這3個物種為一個科，同屬蘭科植物，與所對比其他物種親緣關系較遠。

圖6 BsGMP序列及其推導氨基酸序列Fig.6 Bletilla striata GMP gene sequence and its deduced amino acid sequence

圖7 BsGMP蛋白結構域預測Fig.7 Conserved domains of BsGMP

圖8 白及GMP蛋白三維結構Fig.8 Three dimensional structure of GMP protein from Bletilla striata

圖9 基于GMP基因同源性的系統進化樹Fig.9 Phylogenetic analysis of GMP gene from Bletilla striata

生物體中存在2種類型的GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因，分為A型和B型。何春梅[15]克隆了3個鐵皮石斛GMP基因，分別命名DoGMP1、DoGMP2和DoGMP3，其中DoGMP1 和DoGMP3屬于B 型，而DoGMP2屬于A型，但3者都具有較高的同源性；對DoGMP1蛋白進行亞細胞定位，發現該蛋白與其它植物GMP家族的成員相似，主要分布在細胞質中。根據本試驗結果對蛋白結構進行預測及分析，發現該蛋白有2個可能的內部到外部跨膜螺旋區和2個可能的外部到內部跨膜螺旋區，BsGMP編碼的蛋白定位于細胞質，在線粒體中也有分布。BsGMP蛋白功能保守結構域的分析表明，該蛋白含有醛酮還原酶的保守結構域(第1～24個氨基酸)和LbetaH家族保守區(第256～335個氨基酸)，這些保守區在細胞壁多糖合成、蛋白糖基化及蛋白轉錄后調控等過程中具有重要作用[19-20]。特定蛋白有不同的螺旋數與轉角數，結構的不同直接影響基因功能的不同，因此，下一步需要通過轉基因方法來驗證其功能，這對于進一步了解白及甘露糖合成關鍵酶基因GMP的功能及多糖合成分子機理具有重要意義。

隨著生物技術的迅速發展，RACE技術為基因克隆提供了方便簡潔的方法。操作中尤其要對逆轉錄產物進行純化，以及在目的產物擴增中設計好特異引物，避開發夾結構和引物二聚體，防止產生大量非特異性或截短的產物。基因克隆技術的成熟完善，我們可以較易地通過克隆目的基因，并進一步研究基因的功能結構，今后可利用轉基因技術提高白及GMPase的活性，通過增加多糖生物合成前體GDP-甘露糖的供應，達到大幅度提高白及塊莖多糖含量的目的，為培育富含多糖的白及新品種提供理論依據。

4 結 論

從白及葉片中克隆到1個GMP基因的全長cDNA，命名為BsGMP，其長度為1523 bp，包含1086 bp的完整開放閱讀框，編碼361個氨基酸。BsGMP氨基酸序列與其他物種氨基酸序列相似性為64.0 %～95.0 %。預測BsGMP編碼的多肽分子量為39.05 kDa，含量最大的3種氨基酸為：Val、Leu和Gly，等電點為6.03，定位于細胞質，為不穩定蛋白，在線粒體中也有分布，并有2個可能的內部到外部跨膜螺旋區和2個可能的外部到內部跨膜螺旋區。預測BsGMP蛋白有11個α螺旋，33個β折疊，46個β轉角，從第1～24個氨基酸含有醛酮還原酶的保守結構域，第256～335個氨基酸含有LbetaH家族保守區，這些保守區是BsGMP蛋白酶活的結合區域，主要參與細胞壁多糖合成、蛋白糖基化及蛋白轉錄后調控等。