芥子堿降解菌對肉種雞產蛋性能和免疫功能的影響

余 丹，李 斌，屈 東，鄒成義，汪林書

(1.四川省畜牧科學研究院飼料研究所，四川 成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川 成都 610066)

【研究意義】芥子堿是菜籽粕等十字花科類飼料中主要抗營養因子之一，也是誘發畜禽發生魚腥味綜合征[1]的主要前體物質，嚴重影響畜禽生產及產品品質。【前人研究進展】目前，芥子堿降解微生物的研究主要集中在真菌上[2-3]，但降解效果不穩定、效率不高，也未見這些微生物安全性評價報道。相對于真菌，細菌的基因簡單，代謝旺盛，繁殖速度快，更有利于商業化生產，因此篩選安全高效的芥子堿降解菌，應用前景更加廣闊，但關于細菌對芥子堿降解的報道極少。本項目組著眼于細菌對芥子堿降解的優勢，經過長期大量篩選，已成功分離培養出了一些芥子堿降解優勢細菌[4]，這些細菌來源廣泛、培養條件簡單，對芥子堿的降解能力強，但它們對動物機體會產生何種影響，目前還未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】本研究擬考察項目組前期分離培養的一株雞源芥子堿降解菌1(sinapine degrading bacteria 1,SDB1)對肉種雞產蛋性能和免疫功能的影響?！緮M解決的關鍵問題】為該菌株進一步應用研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗腹腔注射用SDB1菌株為本實驗室前期從肉種雞腸道中分離培養獲得的芥子堿降解優勢菌。

1.2 動物與試驗設計

本試驗在四川省畜牧科學研究院簡陽實驗基地進行。將324只50周齡健康肉種雞預飼1周后，平均分成6個組。組1：一次性腹腔注射1 mL生理鹽水；組2～6分別一次性腹腔注射1 mL濃度為106、107、108、109、1010CFU/mL的SDB1菌液，每個組6個重復，每個重復9只雞。試驗雞喂養14 d。試驗雞采用3層階梯式籠養，每籠3只雞。平均每只雞每天飼喂125 g同一基礎飼糧?；A飼糧配方參照NRC(1994)和中華人民共和國農業行業標準——雞飼養標準(2004)結合生產實際配制，如表1所示。營養水平除代謝能為計算值外，其余均為實測值。

1.3 樣品收集和指標測定

試驗結束后，以重復為單位，每天記錄試驗雞的產蛋量、蛋重，計算每個重復的平均產蛋率和蛋重。試驗結束時，以重復為單位稱重，每個重復選一只接近平均體重的試驗雞翅靜脈采血8 mL，分別制備血清和抗凝全血。采用酶聯免疫法測定血清免疫球蛋白M (Immunoglobulin M，IgM)、免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)、分泌型免疫球蛋白A (Secreted immunoglobulin A，sIgA)、白細胞介素1(Interleukin 1，IL-1)、白細胞介素2(Interleukin 2，IL-2)、γ干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)、補體C3(Complement 3，C3)、補體C4(Complement 4，C4)水平，試劑盒購自南京建成賽浩科技有限公司；采用流式細胞儀測定外周血CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+淋巴細胞比例。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(飼喂基礎)

注：1)預混料為每1 kg飼料提供：鐵80.00 mg，銅8.00 mg，錳100.00 mg，鋅80.00 mg，碘0.90 mg，硒0.3 mg；2)預混料為每1 kg飼料提供：VA 16000.00 IU，VD 4800.00 IU，VE 60.00 IU，VK3 6.00 mg，VB1 6.00 mg，VB2 16.00 mg，VB12 0.04 mg，葉酸2.80 mg，生物素0.24 mg，煙酸 68.00 mg，D-泛酸21.60 mg。

表2 腹腔注射SDB1對肉種雞產蛋性能的影響

注：同行肩標無字母或有相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。 Note: In the same row,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean very significant difference (P<0.01). The same as below.

1.4 統計分析

原始數據用Excel 2010進行整理，采用IBM SPSS Statistics 22對數據進行統計分析，采用one-way ANOVA法對數據進行方差分析，采用LSD法對差異顯著的結果進行多重比較，各組間數據差異顯著水平為P<0.05。結果采用平均數±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 SDB1對肉種雞產蛋性能的影響

如表2所示，預飼期各組間產蛋率差異均不顯著，正試期SDB1的劑量對肉種雞產蛋率有顯著影響(P<0.05)，其中組3產蛋率最高，顯著高于組4(P<0.05)，極顯著高于組5(P<0.01)和組6(P<0.01)，而組6產蛋率是最低的。組1的產蛋率與其余各組之間差異不顯著(P>0.05)，但在數值上低于組2和組3。無論預飼期還是正試期，各組之間蛋重差異均不顯著(P>0.05)。

2.2 SDB1對肉種雞免疫球蛋白的影響

如表3所示，腹腔注射SDB1對肉種雞血清IgM水平有極顯著(P<0.01)的影響。其中，組3的IgM水平最低，極顯著低于組2、組4和組5 (P<0.01)。SDB1對肉種雞血清IgG和sIgA水平的影響沒有達到顯著水平((P>0.05)，但組6的IgG水平在數值上最高，為組2的4.43倍；組5的sIgA水平在數值上最高，為組3的2.76倍。

2.3 SDB1對肉種雞外周血淋巴細胞比例的影響

如表4所示，腹腔注射SDB1對肉種雞外周血CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+淋巴細胞比例沒有顯著影響(P>0.05)。各組CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+水平差異不顯著(P>0.05)，但從數值上看，組1的CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+均最高。

2.4 SDB1對肉種雞細胞因子的影響

如表5所示，腹腔注射SDB1對肉種雞血清IFN-γ水平的影響沒有達到顯著水平(P>0.05)，但組5的IFN-γ在數值上最高，分別比組1和組3高55.97 %和50.40 %，組4的IFN-γ比組1高52.97 %。腹腔注射SDB1對肉種雞血清IL-1和IL-2水平有顯著影響(P<0.05)，其中組5和組6的IL-1水平顯著高于組2和組3(P<0.05)；而組6的IL-2水平顯著高于除組5外的所有組(P<0.05)，極顯著高于組1(P<0.01)；組5的IL-2水平顯著高于組1、組3和組4(P<0.05)。細胞因子隨劑量的變化規律也呈現出與產蛋性能相反的趨勢。

表3 腹腔注射SDB1對肉種雞血清免疫球蛋白的影響

表4 腹腔注射SDB1對肉種雞外周血淋巴細胞比例的影響

表5 腹腔注射SDB1對肉種雞血清部分細胞因子的影響

表6 腹腔注射SDB1對肉種雞血清補體C3和C4的影響

2.5 SDB1對肉種雞血清補體C3和C4的影響

如表6所示，腹腔注射SDB1對肉種雞血清補體C3和C4的影響沒有達到顯著水平顯著影響 (P>0.05)，但組5的C3水平最高，分別比組1和組4高59.92 %和60.01 %。

3 討 論

SDB1是本項目組前期分離培養的一株芥子堿降解優勢菌，能在體外有效降解芥子堿，但它對動物機體有何直接影響，目前還不清楚。本文研究了一次性腹腔注射SDB1對肉種雞產蛋性能和免疫功能的影響，結果腹腔注射低劑量SDB1(≤107CFU/mL)顯著提高了肉種雞的產蛋率。前人在凝結芽孢桿菌上的研究也得到類似結果[5]。本研究中，腹腔注射高劑量SDB1(>108CFU/mL)對肉種雞產蛋性能產生了不良影響，這與Marcq等[6]研究結果相似。但向峰等[7]指出益生菌(0.2 %的濃度≥2×108CFU/mL的枯草芽孢桿菌和0.02 %的濃度≥1×1010CFU/mL的屎腸球菌)對泰和烏雞的生長性能也沒有顯著影響，這些研究使用的微生物劑量范圍與本研究組4的數量級一致，結果也類似，說明微生物對動物生產性能的影響與其劑量密切相關。

動物生產性能是機體免疫狀態的外在體現。機體對外來物質免疫應答的表現形式主要是以B細胞介導的體液免疫和以T細胞介導的細胞免疫。反映體液免疫功能指標最主要的是IgM、IgG、IgA等免疫球蛋白。IgM是初次體液免疫反應產生最早的免疫球蛋白，具有殺菌、溶菌、溶血、促進吞噬及凝集的作用；IgG是介導體液免疫的主要抗體；IgA分為血清型和分泌型，其中分泌型的sIgA是機體黏膜免疫的一道屏障，具有抗菌、抗病毒、抗毒素的免疫學活性[8]。本研究中低劑量組(≤107CFU/mL)免疫球蛋白水平普遍較低，而高劑量組(≥108CFU/mL)免疫球蛋白水平較高。這說明腹腔注射大于107CFU/mL的SDB1才能有效刺激肉種雞的體液免疫系統。目前微生物對動物體液免疫系統的影響研究報道較多，普遍的結果是有益菌能增強機體免疫功能而有害菌會降低機體免疫功能。Salim等[9]的研究指出：與對照組和抗生素組相比，在肉雞飼料中添加0.1 %的羅伊氏乳桿菌或乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母的混合物，可以顯著提高肉雞IgA、IgG、IgM水平，且添加乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母的混合物的效果優于單獨添加羅伊氏乳桿菌。任貴強[10]等研究指出給小鼠飼喂不同劑量的兩種乳酸桿菌，結果低、中劑量組血清IgG水平隨著飼喂時間不斷增加，有超過高劑量組的趨勢。本研究的結果表明了SDB1能有效刺激肉種雞以IgM為主的體液免疫功能，這與上述有益菌的試驗結果相似，具體作用效果的差異可能與劑量有關。

細胞免疫是指T細胞受到抗原刺激轉化為致敏T細胞，致敏T細胞及其所釋放的細胞因子對再次進入的抗原的直接殺傷和協同殺傷作用[8]。根據T細胞表面抗原的差異，可將T細胞分為CD4+和CD8+兩個亞群，前者具有輔助性T細胞的功能，主要包括CD2+、CD3+、CD4+、CD8-；后者具有抑制性和殺傷性或細胞毒性T細胞的功能，主要包括CD2+、CD3+、CD4-、CD8+。本研究結果顯示腹腔注射SDB1后，肉種雞外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+淋巴細胞比例沒有顯著變化，說明SDB1對肉種雞細胞免疫功能沒有顯著影響。本研究中血液樣本是在攻毒后2周采集的，出現這種結果的原因是否是T細胞表面抗原的初期的免疫應答已經趨于平穩，或者是原本就從未產生過顯著的應答有待進一步研究。因此，下一步更應該從抗原應答的角度關注初始T細胞、活化T細胞和記憶T細胞等的情況。

細胞因子是免疫細胞受刺激后產生的非抗體、非補體類具有急速樣性的蛋白質分子，主要包括干擾素(interferon, IFN)、白細胞介素(interleukin, IL)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF)等四大系列。IL-1能誘導T、B細胞活化增殖，促進T細胞對抗原的激活。IL-2具有廣譜的免疫增強活性，可誘導T、B細胞增殖分化，促進細胞毒性T前體細胞分化為細胞毒性T細胞，并增強其殺傷效應。IFN-γ則對體液免疫和細胞免疫均具有很強的免疫調節作用，能通過下調轉鐵蛋白受體，減少細菌供鐵量；誘導內源性一氧化氮生成，直接抑制細胞內細菌或增加單核巨噬細胞的溶酶體溶解細菌作用，共同消滅細菌[8]。本研究結果表明高劑量腹腔注射SDB1后2周，肉種雞血清IL-1和IL-2水平顯著增加；盡管高劑量組IFN-γ水平與低劑量組之間的差異沒有達到統計學上的顯著水平，但在數值上已經超過50 %，說明腹腔注射SDB1對IFN-γ也是存在影響的。由于血液樣本為SDB1攻毒后2周采集的，可見，腹腔注射SDB1可持續有效的刺激肉種雞血液中部分細胞因子。

補體是一組具有酶活性的蛋白質，是體內重要的免疫效應放大系統, 發揮機體特異性和非特異性的抗感染作用[8]。補體的激活主要有3種途徑，即經典途徑、旁路途徑和MBL 途徑。補體C3是補體系統中含量最高且起關鍵作用的一種成分，所有補體激活途徑均需C3參與。C4是經典途徑和MBL 途徑的一個重要組分，但不參與旁路途徑。本研究結果中，腹腔注射SDB12周后，盡管各組血清C3和C4水平差異不顯著，但組5比組1和組4均高出60 %左右，因此， SDB1對C3的影響也是不可忽視的。本試驗C4的水平在各組差異很小，幾乎沒有變化，這是免疫急性期已過，C4的釋放量已經趨于平穩，還是存在其它原因，目前還不清楚，需要進一步研究。

4 結 論

SDB1是本項目組前期分離培養的一株芥子堿降解優勢菌。本研究結果表明，低劑量SDB1(≤107CFU/mL)對肉種雞產蛋性能和免疫功能沒有不良影響；而高劑量SDB1(≥108CFU/mL)會顯著增強肉種雞部分體液免疫和細胞因子水平，但此免疫增強效應是以降低產蛋性能為代價。由于微生物產品的有效性與劑量、給藥方式、作用時間、受試動物個體差異等因素均密切相關，若要將SDB1應用于生產實際，還需要更多的動物試驗進行支撐。下一步有必要繼續研究口服或拌料給予SDB1對肉種雞的影響。